Мы используем cookie файлы.
Пользуясь сайтом, вы соглашаетесь с нашей Политикой конфиденциальности.

Антибиотики, структура генома и CRISPR: чем занимается в Сколтехе лаборатория Северинова

Пятница , 23.08.2019
Биомолекула

В статье читатель узнает подробности внутренней жизни лаборатории изучения метаболизма прокариот Центра наук о жизни в Сколковском институте науки и технологий и ее исследовательской работы

Надо только любить то, что ты делаешь, и очень много работать.
Константин Северинов

Студенты, уже получившие степень магистра, рассказывают о планируемых темах кандидатских диссертаций, среди которых: «Характеристика компонентов комплекса теломеразы в семействе крестоцветных», «Взаимодействие Clostridium difficile и бактериофага при использовании фаговой терапии» и «Оффтаргетная деградация клеточных РНК, вызванная нуклеазой CRISPR-Cas13a».

Руководитель лаборатории в довольно непринужденной манере критикует работы студентов, бегло выявляя слабые места и внося необходимые правки. Сразу бросается в глаза расслабленная атмосфера, совсем не похожая на предзащиты и аналогичные собрания в университете. Такой необычный для вуза и «классической академии» стиль напоминает скорее работу команды доктора Хауса.

Что же это? Это lab meeting исследовательской группы Константина Северинова из Центра наук о жизни (Center of Life Sciences, CLS) Сколтеха, посвященный будущим аспирантским работам.

 severinov_photo2_1437311223.jpg.600x450_q85.jpg

Константин Северинов


Индекс Хирша: 63.

Научные интересы

Метаболизм прокариот, а именно их взаимодействия с вирусами и друг с другом. Сюда относятся и изучение микроцинов (это бактериальные антибиотики, нацеленные на другие микроорганизмы), и исследования CRISPR-систем, и научные изыскания в области организации бактериального генома.

Образование

Северинов в 1990 году окончил биофак МГУ, затем некоторое время работал в Пущино. Еще на пятом курсе прошел стажировку в лаборатории Бристольского университета в Великобритании. После этого поступил в аспирантуру Института молекулярной генетики РАН, откуда по программе обмена молодыми учеными Джорджа Сороса уехал в США и два года работал в лаборатории Колумбийского университета у Алика Гольдфарба. После этого вернулся в Россию и в 1993 году защитил кандидатскую диссертацию по теме «Доменная организация бета-субъединицы РНК-полимеразы Escherichia coli».

Карьера

Северинов работал в США: сначала в Рокфеллеровском университете, позже стал профессором Института микробиологии Ваксмана в Ратгерском университете, где возглавил свою лабораторию, активно работающую до сих пор. В 2005 году организовал собственную исследовательскую группу в Институте молекулярной генетики РАН. В 2011-м Северинов входил в «запускающую команду» создания Сколтеха. В 2013 году заявка Северинова выиграла конкурс мегагрантов, в связи с чем он решил основать лабораторию молекулярной микробиологии в Политехническом университете Санкт-Петербурга.

Сейчас помимо группы в Сколтехе Константин Викторович заведует лабораториями регуляции экспрессии генов мобильных элементов прокариот в Институте молекулярной генетики (ИМГ) РАН, молекулярной генетики микроорганизмов в Институте биологии гена (ИБГ) РАН, на базе которой создана кафедра Сколтеха, а также исследовательским центром Сколтеха в СПбГУ и лабораторией в Ратгерском университете в США. Также, по версиям Web of Science и Scopus, Северинов является одним из самых цитируемых ученых в России.

 

Карьерный путь Северинова весьма извилист. Вот так рассказывает о нем Анна Лопатина, бывшая аспирантка лаборатории Северинова в ИМГ, которая сейчас работает постдоком в лаборатории Ротема Сорека в Институте Вейцмана в Израиле:

"Я была студенткой микробиологии почв и делала диплом по почвенным бактериофагам. К пятому курсу стало понятно (из статей и по слухам), что Константин — самый сильный ученый в стране, у которого можно было бы продолжить изучать фагов. Я ему написала, и он взял меня в аспирантуру в ИМГ. Это был 2008 год, он сравнительно недавно вернулся в Россию. Первые несколько лет аспирантуры я занималась микробным разнообразием снега Антарктики и ездила туда два раза в экспедицию, а потом уже переключилась на термальные источники с их фагами и криспрами (я была в числе тех, кто положил начало изучению всех этих направлений в лабе). В то время были еще на подъеме темы микроцинов, полимеразы бактериофагов и даже уже начинались криспры. Со временем стало всё больше защитных систем микроорганизмов типа криспров и BREX (об этом читайте ниже — прим. автора). В 2015–2016 годах половина аспирантов той первой волны разъехалась, и в лабе появилось огромное количество уже сколтеховских студентов".

2222.png

CRISPR? Антибиотики? Всё вместе!

Основные направления исследований лаборатории Константина Северинова в Сколтехе — многообразие взаимодействий бактерий и вирусов, а также поиск новых антибиотиков. Объединяет обе темы одно — это способы бактерий защищаться и атаковать.Взаимодействие вирусов и бактерийОдна из передовых тем молекулярной биологии — завоевавшие невероятную славу даже за пределами научных кругов CRISPR/Cas-системы [4]. Механизмами их работы с позиций эволюции и экологии — то есть изучением принципов функционирования и влияния CRISPR на микробные сообщества (а не редактированием геномов, как можно было бы подумать), — занимается и лаборатория Северинова.На закономерный вопрос об использовании CRISPR-систем в биотехнологии, который так часто звучит в публичных обсуждениях, руководитель лаборатории отвечает без энтузиазма. «Использование [CRISPR-систем] в биотехнологии настолько скучно и неинтересно, что...» — удрученно качает головой Северинов и тут же приводит в пример рестриктазы, которые сорок лет назад произвели бум, как сегодня CRISPR/Cas, однако теперь представляют интерес лишь как инструмент генной инженерии.

3333.png

Криспры — это не только ценный мех перспективный инструмент редактирования генома, но еще и «генетическая летопись» каждого штамма бактерий. Спейсеры в CRISPR-кассете (фрагменты геномов фагов и плазмид, помещенные в «геномную библиотеку» хозяина) позволяют судить о «прошлом» бактерии.

Вообще, CRISPR/Cas в природе — отнюдь не «генетические ножницы» на потеху биотехнологам, а система адаптивного иммунитета прокариот, которая «запоминает» агрессора (вирус или чужеродную плазмиду) путем внесения частей генома «пришельца» в специальный генетический локус хозяина — в ту самую «кассету». При следующем контакте бактерия, несущая эти фрагменты (спейсеры) в геноме, способна прицельно внести разрыв в ДНК фага/плазмиды, а значит — нейтрализовать агрессора.

«Набор CRISPR-спейсеров, находящийся в популяции бактерий, позволяет вам судить о прошлых взаимодействиях бактерий с вирусом. Сравнивая такие наборы в различных популяциях одного вида, анализируя состав спейсеров и динамику его изменения можно оценить историю этих популяций», — говорит Северинов в интервью «Биомолекуле».

Системы рестрикции-модификации изучают в лаборатории не как механизм защиты бактерий от вирусов, а с позиций «штурма» вирусом этого бактериального «бастиона». Кроме того, исследуют работу системы защиты-сайленсинга.

Почему же одной из центральных тем лаборатории выбрали именно криспры?

«С точки зрения разнообразия, это наиболее интересная для изучения тема. Вот вы смотрите на housekeeping-гены (гены домашнего хозяйства, то есть ДНК- и РНК-полимеразы, рРНК и прочие) — они всегда одинаковые и скучные. А вот системы защиты по определению очень быстро изменяются за счет «гонки» между вирусом и бактерией, или в общем случае между атакующим и защищающимся. Механизмы этого необычайно интересны», — отвечает Константин Северинов. В случае взаимодействий бактерий с вирусом — это CRISPR, в случае взаимодействия бактерий друг с другом — антибиотики.

В 2018 году в широко известном журнале Proceedings of National Academy of Sciences of USA вышла важная статья по этой теме: «Предсказание генов, функционально связанных с CRISPR-Cas-системами, по анализу соседних генов» [9]. В исследовании помимо Северинова участвовал его аспирант Сергей Шмаков (который, кстати, был награжден премией директора Национальных институтов здоровья США за исследования в области новых CRISPR-Cas-систем), а также известный биоинформатик и эволюционист Евгенией Кунин. В публикации описана компьютерная стратегия идентификации и оценки значимости белков, связанных с CRISPR-Cas-системами. Исследователи ввели специальный показатель — CRISPRicity (дословно — «CRISPRичность»), определяющий «силу» связи CRISPR с белок-кодирующими генами архей и бактерий из секвенированных геномов и представляющий собой отношение частоты встречаемости гена в связке с CRISPR к общей частоте встречаемости гена. Гены с этим показателем оценивали аналогично Сas-генам, ранее не относящимся к функционированию CRISPR-Cas системы, а кодируемые ими белки проверяли анализом доменной структуры и коэволюционным анализом. В результате было найдено 79 новых белок-кодирующих генов, вовлеченных в функционирование CRISPR-Cas .

Как же стало возможно предсказывать новые гены в системе адаптивного иммунитета прокариот? У бактерий и архей функционально связанные гены собраны в опероны — группы сонаправленных, сотранскрибируемых и сотранслируемых генов. Последовательности оперонов, участвующих в одних и тех же метаболических путях, у разных видов могут перекрываться. Авторы выделили гены, располагающиеся вблизи CRISPR-локуса, cas1-генов или эффекторного комплекса — бóльшая их часть была описана впервые. Их назвали CRISPR-связанными генами.

В заключение авторы изучили коэволюцию CRISPR-связанных генов с CRISPR-локусом, построили филогенетические деревья и сравнили их с деревьями cas-генов и деревьями 16S рРНК (в качестве контроля). Интересно, что эволюционные расстояния между генами cas10 (большой субъединицы эффекторного комплекса систем II типа) и аналогичные расстояния между генами corA (ионного канала, кодируемого системами подтипа III-B) демонстрируют корреляцию, чего не скажешь про связь любого из этих генов с 16S РНК. Иными словами, гены внутри CRISPR-Сas-локуса коэволюционируют, тогда как сам локус передается в основном горизонтальным переносом генов — одним из ключевых путей микробной эволюции [10].

Горизонтальный перенос генов характерен не только для CRISPR-систем, но и для генов антибиотиков, служащих бактериям оружием и средством общения с себе подобными. Об этом расскажет следующая глава.

Поиск антибиотиков

Вторая важная тема исследовательской группы Северинова — антибиотики, а именно бактериоцины. Это вещества, вырабатываемые бактериями для борьбы с себе подобными. Как и у любого оружия, мишени их действия в бактериальной клетке чрезвычайно разнообразны (рис. 3). Особенно важны среди них для нашего сегодняшнего рассказа микроцины. Это короткие пептиды, которые приобретают специфические свойства (например, способность подавлять рост других бактерий) только после посттрасляционной модификации .

4444.png

Различные группы антибиотиков и мишени их действия в бактериальной клетке. Вкратце о механизмах действия антибиотиков: блокирование синтеза клеточной стенки ведет к невозможности делиться и часто к гибели бактерии; остановка синтеза белка оставляет бактерию без молекулярных машин, выполняющих практически все функции; встраивание антибиотиков в мембрану влечет за собой нарушение ее проницаемости и гибель от осмотического стресса; фолат — кофактор многих ферментов, поэтому ингибирование его синтеза останавливает синтез ДНК/РНК и белков; блокирование синтеза нуклеиновых кислот приводит как к прекращению синтеза белка, так и к невозможности деления.

  Все важные химические модификации микроцинов закодированы в геноме неразрывно с «базовой» аминокислотной последовательностью самого антибиотика: в последовательности ДНК непосредственно за гéном пептида располагаются гены ферментов, которые его модифицируют. Такой кластер легко найти в геноме при помощи методов биоинформатики. По нему часто можно сказать, какой пептид получится в результате, поскольку функции большинства ферментов-модификаторов известны, как и последовательность аминокислот пептида.
000001.jpg

  В своей недавней статье в Nature Chemical Biology (одном из наиболее высокорейтинговых и уважаемых зарубежных журналов) сотрудники лаборатории задались целью найти новый антибиотик как раз с помощью биоинформатического «геномного поиска» (Genome mining; см. врезку ниже для объяснения этого алгоритма) [12]. В качестве «наживки» для поискового алгоритма использовали известный у E. coli микроцин B17 (MccB17) — сильный ингибитор ДНК-гиразы (о которой ниже речь пойдет отдельно), кодируемый кластером mcbABCDEFG. Этот «невод» принес гомологичные белки в геноме бактерии Klebsiella pneumoniae подвида ozaenae, организованные в очень похожий кластер.   

Genome mining: как «выудить» из метагеномных баз новый антибиотик

С помощью подхода Genome mining (геномный поиск) исследователи под руководством Константина Северинова ищут в метагеномных образцах биосинтетические кластеры, ответственные за синтез антибиотиков.

Метагеномное секвенирование — секвенирование всей ДНК, содержащейся в пробе среды, будь то грунт литорали, болотная вода или биота кишечника. Соответственно, метагеном — совокупность генов всех организмов, содержащихся в пробе. При работе с ним исследователи не определяют, чья ДНК кому принадлежит; они секвенируют и анализируют сразу всю совокупность. Освежить в памяти методы секвенирования вы можете по статье «12 методов в картинках: секвенирование нуклеиновых кислот» [16].

Такой поиск рассчитан на прокариот, так как четкие кластеры генов, которые можно было бы определить биоинформатически, у эукариот отсутствуют. Но на бактериях такой поиск дает прекрасные результаты. Одним из наиболее популярных способов геномного поиска, используемый и в лаборатории Северинова, является алгоритм antiSMASH [13], который применяют для предсказания путей биосинтеза вторичных метаболитов. В его основу легло «картирование» расположения генов синтеза данных веществ в генетических кластерах.

5555.png


Как геномный поиск позволяет находить новые кластеры генов. Сверху — хорошо изученный кластер известного антибиотика MccB17 (он использовался как «наживка» для поиска). Снизу — найденный в геноме клебсиеллы кластер, отвечающий за синтез неизвестного до сих пор антибиотика клебсазолицина, ингибитора трансляции. Обозначение генов в кластерах: A — «исходный» ген антимикробного пептида (микроцина), подлежащий посттрансляционной модификации; B–G — гены ферментов, осуществляющих эту модификацию для получения «зрелого» пептида. Гены ферментов используются исследователями как поисковый запрос к метагеномным данным: именно по ним ищут новые кластеры, из которых в дальнейшем выделяют новые микроцины.

  

А как дальше ищут кластеры этих генов? Поиск проводят в геномных или метагеномных данных. После этого либо берут штамм бактерии, в котором был найден кластер, и выделяют из него изучаемый белок, либо экспрессируют его в другом штамме-продуценте. И наконец можно приступать к изучению его свойств, механизмов действия и молекулярных мишеней.

Существенный недостаток метода в том, что он основан на гомологии генов белков, модифицирующих микроцин, с известными генами. Найти негомологичные последовательности таким способом невозможно.

  

Последовательность предшественника предсказанного микроцина KlpA не была похожа на известные ранее микроцины, а значит, зрелый KlpA должен был иметь необычную структуру и функциональные характеристики. Найденный микроцин решили назвать клебсазолицином (KLB, рис. 5) — по роду бактерии, в которой он синтезируется.

Так был найден новый антибиотик. Но самое интересное — механизм его действия.

Чтобы удостовериться, является ли клебсазолицин ингибитором трансляции, исследователи использовали in vitro систему синтеза люциферазы. Эта система подразумевает наличие в пробирке всех реагентов реакции окисления люциферина, кроме люциферазы (то есть сам люциферин, АТФ и кислород), а также рибосом и мРНК гена люциферазы. В данном случае в пробирку также добавляли ингибитор трансляции. Когда ингибитор работает, трансляция подавляется, и свечение пропадает. Так и случилось в присутствии клебсазолицина, а значит, он блокирует именно работу рибосомы.

Чтобы разобраться в механизме этого ингибирования, исследователи из Сколтеха объединили усилия с коллегами из Чикаго, специализирующимися на структурных исследованиях рибосомы. Группа под руководством Ю.С. Поликанова из Университета Иллинойса закристаллизовала рибосомы Thermus thermophilus в присутствии KLB, мРНК и тРНК в А-, Р- и Е-сайтах и установила 3D-структуру комплекса с разрешением 2,7 Å, опираясь на уже известную модель рибосомы этой бактерии. Оказалось, что клебсазолицин закрывает туннель выхода растущего пептида в большой субъединице (рис. 5). В статье авторы также сравнили расположение клебсазолицина с другими рибосомными антибиотиками, а именно эритромицином и хинупристином.

В работе участвовали исследовательские группы разных вузов и институтов: Политехнического университета и Института ядерной физики (Санкт-Петербург), Института антимикробной химиотерапии (Смоленск), Сколтеха, Института биологии гена РАН, МГУ (факультетов: химического, биоинженерии и биоинформатики, а также Института Белозерского) (Москва), Университета Иллинойса и Института Ваксмана (США).


Лаборатория