Мы используем cookie файлы.
Пользуясь сайтом, вы соглашаетесь с нашей Политикой конфиденциальности.

Приглашенный ученый Сингх Прим Великобритания
Номер договора
14.Y26.31.0024
Период реализации проекта
2018-2020
28
Количество специалистов
14
научных публикаций
Общая информация

Выявление и описание так называемых «импринтированных» генов показали, что вклад обоих родителей необходим для нормального развития млекопитающих - импринтированные гены действуют как барьер для партеногенетического развития, и поэтому «девственное» рождение никогда не наблюдается у млекопитающих. Ученые лаборатории предположили, что должна существовать эволюционно консервативная молекулярная связь между механизмами, которые регулируют эффекты родительского происхождения у насекомых и у млекопитающих. Задача ученых лаборатории стоит в том, чтобы выяснить конкретные молекулярные и клеточные аспекты эволюционно консервативных механизмов, которые регулируют эффекты родительского происхождения у животных. Достижение этой цели будет иметь большую важность как для понимания эволюционных отношений, так и для практического применения в восстановительной медицине, где правильная регуляция импринтированных генов необходима для получения терапевтически жизнеспособных эмбриональных стволовых клеток.

Название проекта:

Неменделевское наследие: консервативные механизмы генетического импринтинга

Приоритет СНТР: в


Цели и задачи

Направление исследований: Механизмы генетического импринтинга у животных

Цель проекта: Исследование роли консервативных гетерохроматиновых факторов в регуляции импринтинга у животных


Практическое значение исследования

Научные результаты:

  • Организованы колонии P. citri и S. coprophila в Новосибирском государственном университете (Россия). Линии P. citri привезены из Университета Тосканы (Италия) и из Университета Эдинбурга (Великобритания). В лаборатории эпигенетики созданы все условия для содержания и размножения P. citri, получена устойчивая колония, обеспечивающая достаточное количество биологического материала для проведения экспериментов. Линии S. coprophila привезены из Университета Эдинбурга (Великобритания) и получены из Брауновского университета (США). В настоящее время в коллекции поддерживается 7 линий S. coprophila, несущих различные генетические маркеры и хромосомные перестройки, необходимые для работы.
  • Для получения фрагментов генов деметилаз H3K9 и генов метилаз Н3К9 и Н4К20 проведен биоинформатический поиск в черновой сборке генома P. citri гомологов соответствующих генов у Drosophila melanogaster. В результате для каждого гена Drosophila melanogaster было обнаружено от 1 до 5 гомологов в геноме P. citri. Получение фрагментов генов для дальнейшего получения двуцепочечных РНК проводили при помощи специфических праймеров, несущих на 5’ концах последовательности промотора РНК-полимеразы фага T7. В качестве матрицы для ПЦР была использована геномная ДНК P. citri или препарат кДНК, приготовленный из тотальной РНК взрослых самок. Полученные фрагменты клонированы в плазмидные векторы и верифицированы секвенированием. Аналогичная работа проведена для S. coprophila. В результате получены фрагменты генов деметилаз H3K9 и генов метилаз Н3К9 и Н4К20 из двух модельных организмов, подготовленные для получения препаратов дцРНК для последующего проведения РНК-интерференции.
  • Привезена из клиники Шаритэ (Берлин, Германия) культура эмбриональных стволовых клеток мыши, в которых гены, колирующие HP1beta и HP1gamma, окружены LoxP-сайтами. Кодирующие последовательности этих генов можно удалить с помощью транзиентной трансфекции конструкцией, экспрессирующей рекомбиназу Cre. По плану работ предполагается исследовать эффект от удаления всех паралогов HP1 на метилирование дифференциально метилированных участков ДНК в локусах контроля импринтинга. Таким образом, перед началом экспериментов требовалось удалить ген CBX5, кодирующий белок HP1alpha. Ранее было показано, что удаление этого белка не оказывает влияния на жизнеспособность ЭСК мыши. Для удаления гена CBX5 был применен метод с использованием системы CRISPR/Cas9. Для этого были приготовлены и протестированы на специфичность направляющие РНК, сайты распознавания которых расположены по бокам от кодирующей части гена CBX5. После того как их эффективность была проверена в тестовой системе, была проведена котрансфекция конструкций, экспрессирующих эти направляющие РНК, и конструкции, экспрессирующей нуклеазу Cas9. В результате активности Cas9 ожидалось получение клонов клеток, в которых кодирующая последовательность гена CBX5 удалена в обоих гомологах хромосом. После трансфекции были отобраны 87 клонов, которые проверяли с помощью ПЦР на наличие 13 т.п.н. делеции, которая приводит к полному удалению кодирующей части CBX5. По результатам ПЦР были обнаружены 4 клона, несущие искомую делецию на обоих гомологах хромосом. Наличие делеции было подтверждено секвенированием. Чтобы исключить вероятность транслокации гена CBX5 в результате хромосомной перестройки в полученных клонах была измерена экспрессия гена CBX5 с помощью количественной ПЦР. Во всех 4 клонах экспрессия гена CBX5 не детектировалась.
  • Дальнейшая работа по этому направлению связана с определением уровня метилирования ДНК в локусах контроля импринтинга методами COBRA и бисульфитного секвенирования. Для проведения этих методов были подобраны праймеры для ПЦР, перекрывающие районы метилирования 4 модельных локусов, выбранных для дальнейшей работы.

Образование и переподготовка кадров:

Организована стажировка в лаборатории для 5 аспирантов и 8 студентов.

Организационные и инфраструктурные преобразования:

Создана учебная лаборатория для студентов кафедры цитологии и генетики и кафедры молекулярной биологии факультета естественных наук Новосибирского государственного университета (Россия).

Сотрудничество:

  • Эдинбургский университет (Великобритания): освоены методы работы с модельными организмами Plannococcus citri и Sciara coprophila, проведены научные стажировки
  • Институт клеточной биологии и нейробиологии университетской клиники Шаритэ (Германия): освоены методы работы с эмбриональными стволовыми клетками мыши, проведены научные стажировки
  • RIKEN (Япония): охарактеризовано эпигенетическое состояние и уровень экспрессии импринтированных локусов в эмбриональных стволовых клетках мыши после удаления генов, кодирующих белки семейства HP1
  • Университет Тосканы (Италия): проведение экспериментов по РНК-интерференции генов, кодирующих гетерохроматиновые факторы, в эмбрионах Plannococcus citri
  • Университет Антверпена (Бельгия): методами геномной инженерии с использованием CRISPR получены новые клеточные линии, необходимые для дальнейших исследований
Скрыть Показать полностью
Oyama K., El-Nachef D., Fang C., Kajimoto H., Brown J.P., Singh P.B., MacLellan W.R.
Deletion of HP1γ in Cardiac Myocytes Affects H4K20me3 Levels but Does Not Impact Cardiac Growth. Epigenetics & Chromatin 11(1): 18 (2018).
Singh P.B., Belyakin S.N.
L Chromosome Behaviour and Chromosomal Imprinting in Sciara Coprophila. Genes 9(9): 440 (2018).
Singh P.B., Newman A.G.
Age Reprogramming and Epigenetic Rejuvenation. Epigenetics & Chromatin 11(1): 73 (2018).
Другие лаборатории и ученые
Лаборатория, принимающая организация
Область наук
Город
Приглашенный ученый
Период реализации проекта
Научно-производственный биотехнологический комплекс для проведения работ по изучению, сохранению и практическому применению культивируемых клеток и органов высших растений и микроводорослей

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук

Биология

Москва

Пэк КиЙоп

Корея

2019-2021

Лаборатория клеточной физиологии и патологии

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Орловский государственный университет имени И.С. Тургенева"

Биология

Орел

Абрамов Андрей Юрьевич

Россия

2019-2021

Лаборатория молекулярной онкобиологии

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биологии гена Российской академии наук»

Биология

Москва

Ронинсон Игорь

США

2018-2020