МЕГАГРАНТЫ

Лаборатория стволовых клеток мозга

О лаборатории

Наименование проекта Регуляция деления и дифференцировки стволовых клеток взрослого мозга

Ссылка на сайт лаборатории

№ договора:
11.G34.31.0071

Наименование ВУЗа:
ФГАОУ ВПО «МОСКОВСКИЙ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ (ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ)

Области научных исследований:
Биология

Цель проекта:

Поиск ответов на фундаментальные проблемы происхождения и развития человека современного типа в Северной Азии.

Задачи проекта:

Изучение механизмов регуляции стволовых клеток, процессов их изменения при старении и воздействии лекарств; причин деления клеток или его отсутствия, поиск ответа на вопрос, почему они иногда делятся симметрично и асимметрично; процессов умирания стволовых клеток, их превращения в другие клетки.

 

Ведущий учёный

eniklopov 

ФИО: Ениколопов Григорий Николаевич

 

Ученые степень и звание:
КАНДИДАТ НАУК В ОБЛАСТИ « МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ»

Занимаемая должность:

РУКОВОДИТЕЛЬ ГРУППЫ, ПРОФЕССОР, ЛАБОРАТОРИЯ КОЛД СПРИНГ ХАРБОР (США),
ЗАВЕДУЮЩИЙ ЛАБОРАТОРИЕЙ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК МОЗГА, МФТИ (РОССИЯ),
ЧЛЕН ПРОГРАММ ПО НЕЙРОБИОЛОГИИ, ГЕНЕТИКЕ И МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ, ФАРМАКОЛОГИИ УНИВЕРСИТЕТА СТОНИ БРУК (США)

Области научных интересов:

Стволовые клетки и механизмы клеточной дифференцировки. Нейробиология. Поведение и нейрогенез во взрослом мозге. Передача клеточных сигналов. Биология NO.

Научные достижения: 

Организатор и член организационных комитетов множества научных конференций.
Член научного совета и консультант ряда биотехнологических компаний.

Награды
Обладатель наград и грантов от Национальных институтов здоровья США, Национального
научного фонда США и других государственных и частных фондов США и России.

Encinas, J. M. and Michurina, T. V. and Peunova, N. and Park, J.H. and Tordo, J. and Peterson, D. A. and Fishell, G. and Koulakov, A. A. and Enikolopov, G. N. (2011) Division-Coupled Astrocytic Differentiation and Age-Related Depletion of Neural Stem Cells in the Adult Hippocampus. Cell Stem Cell 8(5) pp. 566-579.

Méndez-Ferrer, S. and Michurina, T. V. and Ferraro, F. and Mazloom, A. R. and MacArthur, B. D. and Lira, S. A. and Scadden, D. T. and Mag'Ayan, A. and Enikolopov, G. N. and Frenette, P. S. (2010) Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature 466(7308) pp. 829-834.

Gleiberman, A. S. and Michurina, T. V. and Encinas, J. M. and Roig, J. L. and Krasnov, P. and Balordi, F. and Fishell, G. and Rosenfeld, M. G. and Enikolopov, G. N. (2008) Genetic approaches identify adult pituitary stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 105(17) pp. 6332-7.

Peunova, N. and Scheinker, V. and Ravi, K. and Enikolopov, G. N. (2007) Nitric Oxide Coordinates Cell Proliferation and Cell Movements During Early Development of Xenopus. Cell Cycle 6(24) pp. 3132-44.

Encinas, J. M. and Vaahtokari, A. and Enikolopov, G. N. (2006) Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain. Proc Natl Acad Sci U S A 103(21) pp. 8233-8.

Результаты исследований

В 2011 году (с 21 октября по 31 декабря) были проведены следующие работы:
1. Разработаны методы двойного и тройного маркирования деления стволовых клеток взрослого мозга
- Разработана методика двойного флуоресцентного мечения включившихся в цепь ДНК синтетических нуклеозидов CldU и IdU.
- Разработана методика тройного флуоресцентного мечения включившихся в цепь ДНК синтетических нуклеозидов EdU, CldU и IdU.
Разработанные методики оформлены в виде стандартизованных протоколов, и позволяют иммуногистохимически и с помощью клик-реакций определять пролиферативный потенциал стволовых и прогениторных клеток по включению в их ДНК меченных аналогов тимидина: галогенированных производных пиримидина - CldU и IdU, а также EdU. Разработанные протоколы дают возможность проследить изменения пролиферативной активности стволовых и прогениторных клеток мозга в ответ на экспериментальное воздействие (малые дозы радиации).
2. Разработаны методики анализа эффектов облучения на поведение и нейрокогнитивные функции животных
- Разработана методика обучения в модели условнорефлекторного замирания
- Разработана методика обучения в модели водного лабиринта Морриса
В ходе разработки был осуществлен анализ имеющейся к настоящему моменту литературы об эффектах облучения на поведение и нейрокогнитивные функции животных.
Разработанные методики позволяют оценить различные аспекты когнитивных функций животных после облучений, такие как успешность их обучения в выбранных задачах, работу как пространственной, так и непространственной памяти, способность животных формировать долговременную память.
Разработанные методики оформлены в виде стандартизованных протоколов
3. Разработана методика организации направленных скрещиваний генетически модифицированных мышей для получения необходимых репортерных линий
Был произведен отбор линий мышей и разработана методика, позволяющая организовать направленные скрещивания генетически модифицированных мышей для получения репортерных линий, необходимых для исследования стадии покоя, деления и дифференцировки взрослых стволовых клеток и клеток-предшественников в нервной и других тканях после воздействия низкими дозами облучения.
Разработанная методика оформлена в виде стандартизованного протокола.
4. Составлен литературный обзор, посвященный анализу современных данных по изменениям нейрогенеза и поведения животных в ответ на радиационное воздействие
Был осуществлен анализ имеющихся к настоящему моменту данных по изменениям нейрогенеза и поведения животных в ответ на радиационное воздействие.
По результатам проведенной работы составлен литературный обзор, который будет использован в дальнейшем при постановке задач будущих экспериментов, при написании статей, а также для подготовки докладов на конференциях и в преподавательской деятельности.

В 2012 году были проведены следующие работы:

Разработан метод мультимаркерного определения стволовых клеток взрослого мозга.

Стволовые клетки взрослого мозга необходимы для сложных форм поведения, репаративного ответа на повреждения, и терапевтического действия ряда лекарственных препаратов и процедур. Одним из главнейших вопросов при изучении стволовых клеток является их идентификация, визуализация, и выявление отдельных субпопуляций стволовых клеток и их потомства. Нами были разработаны методы мультимаркерного определения различных типов клеток в нейрогенных зонах взрослого мозга:
1) Исследованы возможные маркеры нейральных стволовых клеток и их потомства и проведено их тестирование на оптимальное сочетание при конфокальной флюоресцентной микроскопии.
2) Найдены комбинации маркеров, позволяющие, в сочетании с репортерными трансгенами (Nestin-GFP, Nestin-CFPnuc, Nestin-mCherry) и множественным митотическим мечением, надежно распознавать отдельные подклассы стволовых клеток, клеток-предшественников, и дифференцированных клеток взрослого мозга, в том числе клеток, находящихся в различных фазах клеточного цикла.
3) Разработан стандартизированный протокол мультимаркерного определения важнейших подклассов пролиферирующих и покоящихся стволовых клеток взрослого мозга, количественного анализа параметров клеточного цикла этих популяций, и анализа изменений этих параметров в ответ на экспериментальные воздействия.

Разработаны методы визуализации стволовых клеток в целых структурах головного мозга животных.

Рождение новых нейронов из стволовых клеток в мозге взрослых животных (в частности, в гиппокампе) связано с важнейшими когнитивными функциями. Этот процесс отличается динамичностью и число новых нейронов и делящихся клеток может увеличиваться или уменьшаться в ответ на различные стимулы. Для понимания роли взрослого нейрогенеза крайне важно умение визуализировать и оценивать изменения в числе стволовых клеток, делящихся клеток, и новообразованных нейронов. Обычно это достигается анализом выборочных срезов мозга с последующей экстраполяцией к общему объему гиппокампа (или другой изучаемой области мозга). Возможность визуализации стволовых и делящихся клеток в целых структурах мозга могла бы резко увеличить точность и производительность анализа нейрогенеза. Нами было разработано несколько подходов к визуализации нейрогенеза:
1) Иммуногистохимический метод выявления стволовых клеток в целых структурах головного мозга животных. При помощи этого метода были визуализированы стволовые клетки в целом гиппокампе репортерных линий мышей и показана высокая эффективность этого метода по сравнению с известными подходами.
2) Методика выявления пролиферирующих клеток в целых структурах головного мозга животных. Показано, что с помощью клик-реакции возможна визуализация делящихся стволовых и прогениторных клеток в отделах мозга толщиной до 700-900 мкм, тем самым делая возможным анализ нейрогенеза в целом гиппокампе.
3) Методика оптического просветления целых структур мозга репортерных животных. Был создан состав и разработан протокол, позволяющие эффективно визуализировать стволовые клетки в целых структурах мозга при помощи конфокальной и мультифотонной микроскопии.

Разработан метод компьютерного моделирования кинетики деления и дифференцировки субпопуляций стволовых клеток мозга.

Важная проблема, возникающая при изучении динамики деления стволовых клеток - отсутствие инструментария, позволяющего анализировать изменения в нескольких субпопуляциях клеток, способных к делению, исчезновению, и взаимопревращению. Нами разработан алгоритм компьютерного моделирования кинетики деления и дифференцировки субпопуляций стволовых клеток мозга. Проанализирована зависимость числа клеток, меченных двумя нуклеотидами (например, CldU и IdU), от временного интервала между инъекциями этих нуклеотидов. Показано, что анализ данной зависимости позволяет получать информацию о типах клеток, принимающих участие в процессе деления и дифференцировки. Для извлечения данной информации разработан алгоритм, который будет использоваться в дальнейшем при компьютерном моделировании деления и дифференцировки клеток-предшественников нейронов. Хотя алгоритм был разработан для моделирования процесса деления стволовых клеток гиппокампа взрослого мозга, данный подход может быть применен к любой популяции клеток, маркированных двойной меткой и претерпевающих симметричные и асимметричные деления.

Проведена начальная серия экспериментов по облучению животных и анализу стволовых клеток мозга.

Одной из центральных задач проекта является изучение воздействия малых доз различных типов радиации на нейральные стволовые клетки и нейрогенез во взрослом мозге. Нами проведены первые эксперименты по воздействию малых доз различных типов радиации на стволовые клетки и поведение животных.
1) Был разработан и апробирован протокол облучения мышей потоком быстрых нейтронов и гамма-излучением. Этот протокол был использован для облучения животных потоком гамма-излучения с дозами 1 Гр и 5 Гр и потоком быстрых нейтронов с дозами 0.15 Гр, 0.73 Гр, и 3.65 Гр.
2) Для облученных групп животных апробированы методы мультимаркерного определения субпопуляций стволовых клеток и их потомства в нейрогенных областях взрослого мозга.
3) Начата серия экспериментов по анализу острых (спустя 24 часа) и отсроченных (спустя 30 дней) эффектов нейтронного облучения на гиппокампальный нейрогенез и анализу факторов, способных восстанавливать уровень нейрогенеза после облучения умеренными дозами нейтронов.
Помимо значимости для понимания эффектов гамма-излучения и быстрых нейтронов на нейрогенез, проведенные эксперименты комплементируют работу по анализу эффектов облучения на поведение и нейрокогнитивные функции животных.

Выделены множественные субпопуляции стволовых клеток мозга для анализа дифференциальной экспрессии генов.

Для понимания роли и механизмов взрослого нейрогенеза в норме и в ответ на радиацию необходимо выявление молекулярных изменений в стволовых клетках и их потомстве. Основным подходом для решения подобных задач является оценка дифференциальной экспрессии генов в отдельных субпопуляцииях нейрональных предшественников. Первым и критическим этапом такого подхода является выделение очищенных популяций клеток.
Нами был разработан протокол и произведено выделение множественных субпопуляций стволовых клеток мозга из репортерных линий мышей, в частности, из линиии Nestin-GFP. Разработанная методика обеспечивает получение суспензии диссоциированных клеток гиппокампа взрослых животных, высокий выход живых клеток от общего числа выделенных, позволяет осуществлять выделение популяций живых стволовых клеток, экспрессирующих маркерный зелёный флюоресцентный белок, и делает возможным сбор этих клеток для анализа генной активности. Оценка абсолютного количества стволовых клеток показала, что при использовании разработанного протокола из гиппокампа взрослого животного может быть выделено 75*10^3-84*10^3 стволовых клеток, что является достаточным количеством для дальнейшего молекулярного анализа. Это позволит на следующем этапе работы перейти к анализу дифференциальной экспрессии генов и к исследованию эффектов радиационного облучения на разные субпопуляции нейральных стволовых клеток и их потомства.

Проведен анализ острых эффектов облучений на поведение и нейрокогнитивные функции животных.

В основе нашего исследования лежит гипотеза, что низкие дозы облучения, не представляющие острой опасности для организма, тем не менее, могут представлять угрозу для когнитивных функций мозга, поскольку при действии низких доз радиации детектируется нарушение нейрогенеза в гиппокампе. Так как возникновение новых нейронов в зрелом мозге может быть необходимо для обучения, памяти и регуляции эмоционального поведения, дефицит зрелых нейронов, возникший в результате нарушения нейрогенеза под действием ионизирующих излучений, может привести к нарушениям поведения и нейрокогнитивных функций.
Нами показано, что облучение мышей низкими дозами нейтронов 0.146 и 0.73 Гр не приводит к нарушению способности животных формировать обстановочную память после обучения контекстуальному условнорефлекторному замиранию. Были также исследованы острые эффекты высокой дозы облучения мышей Nestin-СFPnuc потоком быстрых нейтронов. Животные получили полулетальную дозу 3.65 Гр. Анализ данных, полученных в установке «PhenoMaster» выявил острые эффекты высоких доз радиации у выживших мышей: нарушения пищевого и питьевого поведения и двигательной активности облученных животных, по сравнению с ложнооблученными. Сниженная моторная координация у облученных животных по сравнению с ложнооблученными была выявлена в тестах на ротароде как на 11 день после облучения, так и через месяц после облучения.

В 2013 году (с 1 января по 30 июня 2013 года) были проведены следующие работы:

Начато проведение основной серии экспериментов по облучению животных и анализу стволовых клеток.

Основная серия экспериментов включала в себя исследования кратковременных и долговременных эффектов облучения быстрыми нейтронами и гамма-радиацией на нейрогенез и стволовые клетки мозга.
Облучение быстрыми нейтронами осуществляли на циклотроне НИЦ Курчатовский институт (бериллиевая мишень, энергия протонов 32 МэВ). Было проведено 4 сеанса облучения мышей трансгенных линий Nestin-GFP и Nestin-CFPnuc с набором следующих поглощенных доз по нейтронам и сопутствующему гамма-излучению соответственно: 0,34 Гр и 0,5 Гр; 0,34 Гр и 0,36 Гр; 0,45 Гр и 0,48 Гр; 0,4 Гр и 0,4 Гр.
Облучение гамма-квантами осуществляли в НИЦ Курчатовский институт. Было проведено 4 сеанса облучения мышей тех же трансгенных линий с набором следующих поглощенных доз гамма-радиации: 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 1,0; 5,0 Гр с целью сравнения эффектов низких и средних доз радиации.
Для анализа пролиферативной активности в гиппокампе животным вводили синтетические аналоги тимидина BrdU за 2 ч до процедуры облучения и EdU за 2 ч до декапитации. Для оценки кратковременных эффектов мышей транскардиально перфузировали и декапитировали через 24 ч после облучения. Перфузию и декапитацию мышей для оценки долговременных эффектов осуществляли через 35 сут после облучения. Для выявления стволовых и делящихся клеток изготавливали серийные срезы мозга и производили иммуногистохимическую окраску на BrdU, GFAP, GFP и клик-реакцию на EdU.
Предварительный анализ полученных данных выявил достоверное снижение числа пролиферирующих клеток в зубчатой фасции гиппокампа. После облучения нейтронами и гамма-квантами в дозах 0,34 Гр и 0,36 Гр, соответственно, число делящихся клеток через 24 ч сокращалось вчетверо: 2447±282 у ложнооблученных и 690±79 у облученных мышей. Такое соотношение наблюдалось как при оценке делящихся клеток на срезах, так и препаратах целых гиппокампов.
После облучения гамма-квантами также наблюдалось достоверное и дозозависимое снижение числа пролиферирующих клеток через 24 ч: у животных контрольной группы и групп 0.5, 1 и 5 Гр - 1404±91, 569±45, 294±39, 47±17 соответственно.
Основной массив полученных данных в настоящий момент находится в обработке.

Проведен анализ долгосрочных эффектов облучения на поведение и нейрокогнитивные функции животных.

Долгосрочные эффекты облучения на поведение исследовались после облучения на двух источниках излучения; эксперименты проводили с 3 по 5 недели после облучения. В первом эксперименте были исследованы животные обоих полов линии Nestin-GFP (10-13 животных в группе). Облучение проводилось на циклотроне НИЦ Курчатовский институт (бериллиевая мишень, энергия протонов 32 МэВ) 0,4 Гр нейтроны и 0,4 Гр сопутствующее гамма-излучение. Во втором эксперименте участвовали самцы линии Nestin-CFPnuc, которые были разбиты на 3 группы: ложнооблученные животные и животные облученные дозами 1 и 5 Гр (9-11 животных в группе). Облучение проводилось на гамма-источнике НИЦ Курчатовский институт, мощность излучения для двух облученных групп была одинакова.
В обоих типах экспериментов оценивалась общая активность животных, а также уровень тревожности в тестах открытое поле и приподнятый крестообразный лабиринт. Достоверных различий между группами выявлено не было.
В первом эксперименте оценивалась обстановочная память животных в модели условнорефлекторного замирания. Различий между группами выявлено не было, но наблюдались достоверные различия по внутригрупповой динамике от теста к тесту для контрольной группы. Животные облученной группы хуже дифференцировали опасный и безопасный контексты. Анализ был проведен для групп самцов.
Во втором эксперименте были проведены тесты на распознавание нового объекта, на обстановочную память животных в модели условнорефлекторного замирания, а также на пространственную память в лабиринте Морриса. Кроме того, был проведен тест на идентификацию целевого объекта в зависимости от контекста (модифицированный тест Морриса). Предварительный анализ не показал достоверных различий между группами в модели условнорефлекторного замирания, но наблюдалась сходная с первым экспериментом внутригрупповая динамика. Были выявлены достоверные отличия при обучении в пространственной версии теста Морриса для группы 5 Гр; для двух других групп достоверных отличий выявлено не было. В модифицированной версии лабиринта Морриса животные группы 5 Гр также хуже идентифицировали целевой объект в зависимости от контекста, чего не наблюдалось в группе ложнооблученных животных и группе 1 Гр.

Back to top