МЕГАГРАНТЫ

Лаборатория молекулярной генетики врожденного иммунитета

О лаборатории

Наименование проекта Генетический анализ врожденного иммунного ответа

Ссылка на официальный сайт

№ договора:
11.G34.31.0052

Наименование ВУЗа:
ФГБОУ ВПО "Петрозаводский государственный университет"

Области научных исследований:
Биология

Цель проекта:
Поиск новых генов и их продуктов, которые регулируют вышеупомянутые процессы.

Основные задачи проекта:
Основная проблема, на решение которой направлен представляемый проект, базируется на классическом генетическом анализе признаков, имеющих важное значение при развитии процессов воспаления, сопровождающихся некрозами клеток и активизацией внутриклеточных протеиназ, и ожирения, являющимся следствием нарушения метаболизма. В качестве модельной системы будут использованы классические инбредные линии и дикие производные типы мышей.

Ведущий учёный

vu mini 52 

ФИО: Полторак Александр Николаевич

 

Ученые степень и звание:
Кандидат химических наук, Associate Professor

Занимаемая должность:
Профессор Департамента патологии Факультета медицины Тафтского Университета (США), заведующий лабораторией молекулярной генетики врожденного иммунитета ПетрГУ (Россия)

Область научных интересов:
Молекулярная генетика
Молекулярная иммунология

Основные научные достижения:
1. Позиционное клонирование ЛПС-гена; работа опубликованна в 1998 году, имеет один из самых высоких индексов цитирования в современной биологии (около 6000 ссылок); за эту работу Брюс Бойтлер в 2011 году был удостоен Нобелевской премии по физиологии и медицине;
2. Позиционное клонирование ИЛ12-рецептора, ИРАК2 киназы, ИРАК1БП1

Научное признание:
Член Международного Научного Общества по изучению генома млекопитающих,
Член Американского Иммунологического Общества,
Член Российского Иммунологического Общества,
Ассоциативный редактор журналов PLоS ONE и BMC Immunology;
Рецензент журналов Nature immunology, Journal of Experimental Medicine, PLoS Pathogens, PLoS Genetics, Journal Biological Chemistry, Journal of Immunology
Обладатель грантов Национального института здоровья (США)

Poltorak A.N. Stimulator of interferon genes (STING): A "new chapter" in virus-associated cancer research. Lessons from wild-derived mouse models of innate immunity [Text] / A.N. Poltorak, O.V. Kurmyshkina, T.O. Volkova // Cytokine Growth Factor Reviews. - [UK], 2016. - vol.29. - P.83-91. (ВАК, Web of Science, Scopus)


Surpris G.. Cutting Edge: Novel Tmem173 Allele Reveals Importance of STING N Terminus in Trafficking and Type I IFN Production [Текст] / G.. Surpris, K.A. Fitzgerald, А.Н. Полторак, J.. Chan, M.. Thompson, Илюха, B.. Liu, M.. Atianand, S.. Sharma, Т.О. Волкова, I.V. Smirnova // Journal of Immunology. - USA, 2016. - Т.196, №.2. - С.547-552. (Web of Science, Scopus)


Ram D.. Balance between short and long isoforms of cFLIP regulates Fas-mediated apoptosis in vivo [Текст] / D.. Ram, V.A. Ilyukha, T.O. Volkova, A.. Tai, I.V. Smirnova, A.N. Poltorak // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - USA, 2016. - Т.11, №.6. - С.1606-1611. (Scopus, Web of Science)

Результаты исследований

Согласно плану научных исследований получены мутантные мыши (самцы) путем ступенчатой инъекции нитрозомочевины, получены гибридные и конгенные линии мышей, резистентные к TNF-индуцированному септическому шоку, идентифицированы и охарактеризованы генные локусы, отвечающие за устойчивость к TNF. Проведен сравнительный анализ уровней экспрессии генов у лабораторных и диких мышей по мРНК методом количественной ПЦР, анализ промоторных областей генов, устойчивых к TNF, а также подавление устойчивости генов путем введения антисмысловых мРНК. Проведен сиквенс генома G1 потомков мутантных мышей, идентифицированы мутации в геноме, связанные с TNF-резистентностью и устойчивостью к опухолям, представлен биоинформатический анализ мутантных генов. Изучена экспрессия биомолекул, связанных с пролиферацией и апоптозом при развитии рака репродуктивных органов. Проведено исследование профиля экспрессии генов раннего ответа при преинвазивном, микроинвазивном и инвазивном раке. Проведено комплексное изучение изменений ткани печени при хронических воспалительных заболеваниях. Показано, что ряд воспалительных процессов в печени служат фоном для индукции опухолей. На основе полученных результатов в Роспатент поданы 2 заявки на изобретение, зарегистрированы 4 ноу-хау. Синтезирована группа новых N-оксидированных производных пиридина и хинолина, изучена цитотоксическая и апоптоз-индуцирующая активности реагентов. Показано, что ряд веществ обладает выраженной антиопухолевой активностью. Проведены исследования по модификации данных гетероциклов низкотемпературной плазмой с целью изменения их биологической активности. На основе проведенных исследований разработаны рекомендации по использованию полученных результатов при проведении доклинических испытаний новых лекарственных препаратов антисептического, цитостатического, иммунотропного и липостатического действий.
Результаты научных исследований с успехом внедряются к использованию на малых инновационных предприятиях ООО «НаноФарм» (директор А.В. Семенов) и ООО «БиоГен» (директор У.С. Багина), созданных в 2012 и 2013 гг. Исследования и разработки сотрудников лаборатории поддержаны 10 новыми грантами.
За период выполнения проекта сотрудниками лаборатории направлено в журналы и опубликовано 24 научных статьи, 3 монографии, 12 учебных пособий, разработано 17 новых курсов лекций и практических занятий, используемых в магистерских программах «Биохимия и молекулярная биология» и «Медико-биологические науки», представлены доклады на 35 международных конференциях. На базе лаборатории подготовлено 8 кандидатских диссертаций и 7 выпускных квалификационных работ бакалавров и магистров. Семнадцать сотрудников лаборатории прошли стажировку в ведущих российских и международных научно-образовательных центрах. За период выполнения гранта лаборатория приняла участие в подготовке 8 конференций и научных школ.

Согласно плану научных исследований в процессе работы по тематике проекта получены следующие результаты:
1. Охарактеризованы два новых локуса, которые вносят вклад в TLR4-опосредованный ответ на LPS, а также на некоторые другие агонисты Toll-подобных рецепторов. В частности, локус на хромосоме 10 усиливал ответ на ЛПС, а также на другие TLR-лиганды. Локус на хромосоме 13 оказывал ингибирующее действие на фенотип, заключающееся в снижении уровня цитокинов в ответ на ЛПС и другие TLR-лиганды Перечень генов-кандидатов, расположенных в этих локусах, не содержит ни один из известных компонентов TLR-опосредованной активации, тем самым указывая на новые, ранее неизвестные функции данных генов в реализации изучаемого признака;
2. Локус, принадлежащий хромосоме 10, стимулирует TLR-опосредованный сигналинг. Последующий анализ генов-кандидатов позволил выявить два представителя иммуноглобулинового семейства, а именно GP49a и LILRB4, которые дифференциально экспрессируются в C57BL/6 и MOLF макрофагах и содержат многочисленные полиморфные замены, в том числе преждевременный стоп-кодон в GP49A и пропущенный экзон 5 в LILRB4 (GP49B) у MOLF мышей. Согласно предлагаемой рабочей модели ITIM домен в цитоплазматическом «хвосте» данных белков имеет нарушенную структуру в линии MOLF и поэтому не способен рекрутировать ингибиторную фосфатазу, что придает иммунному ответу в MOLF мышах более выраженный про-воспалительный характер. С использованием техники нокаута в первичных макрофагах было показано, что ген LILRB4 является геном, ответственным за повышение продукции Il-6 у мышей линии MOLF. При этом наиболее специфичным лигандом для LILRB4 является маннан. В настоящее время изучается механизм действия LILRB4 в передаче клеточного сигнала для активации иммунного ответа;
3. Локус на хромосоме 13, обладающий ингибиторным эффектом на TLR-опосредованную активацию, с высоким разрешением картируется в хромосомной области, размер которой составляет 0.4 Mbp, и содержит один аннотированный ген и несколько неаннотированных транскриптов в геноме MOLF, но не C57BL/6 мышей, что делает данные транскрипты главными кандидатами на искомый ген. Согласно предлагаемой на текущий момент модели один из этих транскриптов кодирует lncRNA (длинную некодирующую РНК) или miRNA (микроРНК), которая подавляет один из компонентов транскрипционной активации TLR-зависимого сигналинга, оказывая таким образом ингибиторный эффект на воспалительный ответ в целом. Идентификация ранее неизвестной регуляторной (ингибиторной) РНК, вовлеченной в TLR-опосредованную активацию иммунного ответа, представляет значительную новизну. Локус на хромосоме 13 получил название Lcx (Low CXCL1). Установлено, что Lcx оказывает влияние на транскрипцию генов Cxcl1 и Tnf, не нарушая при этом стабильность их транскриптов. Анализ экспрессии методом глубокого секвенирования следующего поколения и нокаут по мРНК позволили установить гены в пределах локусе Lcx (Cntnap3 и CtsL). При помощи метода серийного ауткросса была получена линия конгенных мышей, содержащих Lcx локус в B6 геноме. Используя полученных конгенных мышей, показано, что локус Lcx влияет на иммунный ответ in vitro и in vivo на бактериальные инфекции, вызванные Клебзелла и Легионелла. Данные результаты подчеркивают физиологическую значимость Lcx в иммунном ответе на грамм-отрицательные инфекции;
4. В результате отдельного генетического скрининга, направленного на изучение дефекта CpG-индуцированного ответа в MOLF макрофагах, был идентифицирован ген, отвечающий за CpG-дефект и кодирующий MRC1 (маннозный рецептор, CD206), который, в свою очередь, участвует в связывании (захвате) и транспортировке CpG-ODN в перитонеальных макрофагах линии «диких» мышей MOLF/Ei. Более того, показано, что в других линиях «диких» мышей для CpG-индуцируемой продукции цитокинов также необходим MRC1. Таким образом, по результатам проведенных исследований были обнаружены новые функции MRC1, а также было показано, что линии «диких» мышей представляют собой важную и незаменимую модель для понимания естественных регуляторов воспалительного ответа, принадлежащих системе врожденного иммунитета;
5. RIP1-киназа представляет собой центральную молекулу, участвующую в некроптозе и высвобождении цитокинов при воспалении. Для изучения баланса между клеточной гибелью и воспалительными реакциями проведены эксперименты по регуляции RIP1. В качестве фенотипических моделей использованы дикие мыши, которые разошлись от общего предка с классическими лабораторными мышами более миллиона лет назад и поэтому обладают высоким уровнем генетического разнообразия. В первом эксперименте MOLF макрофаги обладали высокой устойчивостью к RIP1-опосредованному некроптозу по сравнению с C57BL/6. Другой эксперимент показывал RIP1-зависимую продукцию цитокинов в C57BL/6 и MOLF макрофагах и значительную разницу в уровнях цитокинов в ответ на ингибирование RIP1. Оба результата демонстрируют зависимость от киназной активности RIP1, тем самым предполагая, что: 1 – генетическое картирование признака может выявить мишени RIP1-киназы; 2 – ген(ы) передачи данных функций признака на уровне RIP1 участвуют в реализации некроптоза. Также было показано, что ферментом, непосредственно действующим на RIP1, является деубиквитиназа, CYLD. Далее будет описан новый механизм регулирования CYLD в MOLF, который характеризуется переходом от полноразмерного CYLD к укороченному. Также предполагается эпигенетический механизм регуляции CYLD в качестве переключателя;
6. Проведен ряд экспериментов по изучению функционирования TNF-рецептора у пациентов с онкопатологиями и аутоиммунными заболеваниями (на примере рака шейки матки (РШМ), рака молочной железы (РМЖ), ревматоидного артрита (РА), системной красной волчанки (СКВ) и хронического гломерулонефрита (ХГН)). У пациентов с аутоиммунными патологиями (РА, СКВ и ХГН) концентрация в плазме обоих типов рецепторов TNF (р55 и р75) значительно повышена по сравнению с контрольной группой. Наибольшее повышение наблюдается при РА (острая фаза). Развитие онкологических заболеваний также приводит к повышению рецепторов TNF, причем в зависимости от стадии и локализации процесса может быть повышен либо TNFR1 (р55), либо TNFR2 (р75), либо оба рецептора. Также была изучена частота встречаемости аллельных вариантов промоторов генов TNFR1 в позициях -609 и -1207 и TNFR2 типа в -1709 и -3609 у больных ревматоидным артритом и раком молочной железы. Показано, что аллельные варианты генов рецепторов TNF, ассоциированные с повышенным или пониженным уровнем белка, являются одним из генетических факторов, связанных с развитием ревматоидного артрита и наследственной формы рака молочной железы. Установленный факт следует учитывать при применении антицитокиновой терапии.

На основе полученных результатов опубликовано 10 научных статей, 5 статей представлены в печать, опубликованы 3 монографии, 10 учебных пособий, поданы в Роспатент 3 заявки на изобретение, представлены научные доклады на 28 международных конференциях. Коллектив лаборатории на Международной выставке-конференции «Биоиндустрия-2014» (15-17.10.2014, С.-Петербург) удостоен 2 золотых и 1 серебряной медалей, на Международной выставке «Высокие технологии. Инновации. Инвестиции» (24-26.03.2015, С.-Петербург) 4 серебряных медалей за практические разработки по проекту. На базе лаборатории подготовлены 1 докторская и 1 кандидатская диссертации, 8 выпускных квалификационных работ бакалавров и магистров. Шесть сотрудников лаборатории прошли стажировку в ведущих российских и международных научно-образовательных центрах. Лаборатория приняла участие в подготовке 7 конференций и научных школ.


Method of automatic differentiation of living and dead cells in biological liquids (blood, lymph) with using specialized dyes (ноу-хау)
Method modifying the physical and chemical properties of micro- and nano-sized objects in complex plasma (ноу-хау)
Express method for isolation of mRNA from tissues rich in lipid fractions for subsequent PCR analysis (ноу-хау)
Method for separation of rare subpopulations of white blood cells from the peripheral blood of patients with oncological diseases (ноу-хау)
Method of differential diagnostics of cervical dysplasia and cervical cancer (заявка на изобретение)
Method of quantitative assessment of histological activity in chronic diffuse liver diseases (заявка на изобретение)
Method for genotyping of human blood for predisposition to cardiovascular diseases with the use of polymorphic markers of circadian genes (CLOCK, BMAL1) (ноу-хау)
Method for noninvasive diagnosis of portal hypertension in chronic diffuse liver diseases (an invention) (заявка на изобретение)
Method for early diagnosis of portal hypertension in chronic diffuse liver diseases (заявка на изобретение)

Back to top