МЕГАГРАНТЫ

Научная лаборатория флуоресцентного биоимиджинга

О лаборатории

Наименование проекта «Флуоресцентные белки: новые подходы к изучению механизмов физиологических и патологических процессов в живых системах»

Ссылка на официальный сайт

№ договора:
11.G34.31.0017

Наименование ВУЗа:
ГБОУ ВПО "Нижегородская государственная медицинская академия" Министерства  здравоохранения Российской Федерации

Область научных исследований:
Биотехнологии

Цель проекта:
Разработка новых подходов к изучению механизмов физиологических и патологических процессов в живых системах

Основные задачи проекта:
1. Разработка технологий прижизненного наблюдения опухолевых клеток на лабораторных животных с использованием флуоресцентной микроскопии и томографии;
2. Исследование возможностей генетически кодируемых фотосенсибилизаторов для направленного уничтожения раковых клеток на моделях с использованием клеточных линий и лабораторных животных;
3. Анализ динамики генерации активных форм кислорода в опухолях с помощью генетически-кодируемых сенсоров перекиси водорода;
4. Разработка методов доставки генетически-кодируемых маркеров, сенсоров и фотосенсибилизаторов в опухолевые клетки в лабораторных животных.

Ведущий учёный

vu mini 17 

ФИО: Лукьянов Сергей Анатольевич

 

Ученые степень и звание:
Доктор биологических наук, академик РАН.

Занимаемая должность:
Проректор по критическим биомедицинским технологиям Российского национального исследовательского медицинского университета имени Н. И. Пирогова; зам. директора по науке института биоорганический химии (ИБХ) им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова; научный руководитель НИИ биомедицинских технологий Нижегородской государственной медицинской академии и зав. лабораторией флуоресцентного биоимиджинга НИИ БМТ.

Область научных интересов:
1. Генная инженерия.
2. Анализ структуры и функции геномов эукариот.

Основные научные достижения:
- открытие эффекта селективной супрессии полимеразной цепной реакции и разработка на его основе ряда новых молекулярно-генетических методов, широко используемых для поиска и анализа функционально важных генетических последовательностей;
- клонирование генов флуоресцентных белков у животных различных систематических групп;
- открытие нефлуоресцентных GFP-подобных хромобелков, определяющих окраску многих коралловых полипов;
- открытие фотоактивируемых флуоресцентных белков;
- разработка генетически кодируемого фотосенсибилизатора;
- создание новых инструментов флуоресцентного мечения.

Научное признание:
- премия международной академической издательской компании “Наука” за лучшую публикацию в издаваемых ею журналах (1996 г.);
- победитель конкурсов журнала “Биоорганическая химия” за лучшую статью года (1996, 1997 гг.);
- Открытие флуоресцентных белков коралловых полипов отмечено как одно из главных достижений РАН в области физико-химической биологии (1999 г);
- лауреат премии Президиума РАН им. академика Ю.А. Овчинникова за выдающиеся работы в области физико-химической биологии и биотехнологии (2006 г.);
- автор более 130 научных работ, опубликованных в отечественных и зарубежных периодических изданиях;
- автор 12 российских и зарубежных патентов;
- регулярно читает курс лекций на кафедре молекулярной биологии биологического факультета МГУ.
- лауреат премии «Rusnanoprize»за 2012 в области медицины, фармацевтики и биотехнологии, - за открытие и применение флуоресцентных белков в биотехнологии.

Dmitry S. Bilan, Luke Pase, Linda Joosen, Andrey Yu. Gorokhovatsky, Yulia G. Ermakova, Theodorus W. J. Gadella, Clemens Grabher, Carsten Schultz, Sergey Lukyanov, and Vsevolod V. Belousov. (2013). HyPer-3: a genetically encoded Н2О2 probe with improved performance for ratiometric and fluorescence lifetime imaging. ACS Chemical Biology 8(3), 535-542. (IF 6.446)

Mishina NM, Bogeski I, Bolotin DA, Hoth M, Niemeyer BA, Schultz C, Zagaynova EV, Lukyanov S,Belousov VV. (2012). Can we see PIP(3) and Hydrogen Peroxide with a single probe?Antioxid. Redox Signa l17(3), 505-512. (IF 8.456) 

Sergei Pletnev, NadyaV.Pletneva, Ekaterina A. Souslova, Dmitry M. Chudakov, Sergey Lukyanov, Alexander Wlodawer, Zbigniew Dauter and Vladimir Pletnev. (2012). Structural basis for bathochromic shift of fluorescence in far-red fluorescent proteinseqFP650 and eqFP670. ActaCrystallographica Section D Biological Crystallography D68, 1088–1097. (IF 12.619) 

Shemiakina I.I., Ermakova G.V., Cranfill P.J., Baird M.A., Evans R.A., Souslova E.A., Staroverov D.B., Gorokhovatsky A.Y., Putintseva E.V., Gorodnicheva T.V., Chepurnykh T.V., Strukova L., Lukyanov S., Zaraisky A.G., Davidson M.W., Chudakov D.M., Shcherbo D. (2012). A monomeric red fluorescent protein with low cytotoxicity. Nature Communications 3, 1204. (IF 7.396) 

Mishina N, Tyurin-Kuzmin P, Markvicheva K, Vorotnikov A, Tkachuk V, Laketa V, Schultz C, Lukyanov S, Belousov V. (2011) Does cellular hydrogen peroxide diffuse or act locally? Antioxid. Redox Signal14,1-7. (IF 8.456) 

E.O. Serebrovskaya, T.V. Gorodnicheva, G.V. Ermakova, E.A. Solovieva, G.V. Sharonov, E.V. Zagaynova, D.M. Chudakov, S.A. Lukyanov, A.G. Zaraisky, K.A. Lukyanov. (2011). Light-induced blockage of cell division with a chromatin-targeted phototoxic fluorescent protein. Biochem. J. 435, 65–71. (IF 4.897) 

Q. Wang, L.J. Byrnes, B. Shui, U.F. Rohrig, A. Singh, D.M. Chudakov, S. Lukyanov,W.R. Zipfel, M.I. Kotlikoff, H.Sondermann. (2011). Molecular Mechanism of a Green-Shifted, pH-Dependent Red Fluorescent Protein mKate Variant. PLoS ONE 6 (8), e23513, 1-12. (IF 4.411)

Mamedov IZ, Britanova OV, BolotinDA, ChkalinaAV, StaroverovDB, ZvyaginIV, KotlobayAA, TurchaninovaMA, FedorenkoDA, NovikAA, SharonovGV, LukyanovS, ChudakovDM, LebedevYB. Quantitative tracking of T cell clones after haematopoietic stem cell transplantation.EMBO Mol Med. 2011 Apr;3(4) — P.201-207.(IF 7.795) 

Chudakov DM, Matz MV, Lukyanov S, Lukyanov KA.Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 2010 Jul;90(3). P.1103-63. (IF 30.174) 

Bogdanov A.M., Bogdanova E.A., Chudakov D.M., Gorodnicheva T.V., Lukyanov S.,Lukyanov K.A. (2009). Cell culture medium affects GFP photostability: a solution. Nat. Methods 6 (12), 859–60. (IF 23.565) С

Bogdanov A.M., Mishin A.S., Yampolsky I.V., Belousov V.V., Chudakov D.M., Subach F.V., Verkhusha V.V., Lukyanov S.,Lukyanov K.A. (2009). Green fluorescent proteins are light-induced electron donors. Nat. Chem. Biol. (5), 459–461.(IF 12.948) 

Shcherbo D., Murphy C.S., Ermakova G.V., Solovieva E.A., Chepurnykh T.V., Shcheglov A.S., Verkhusha V.V., Pletnev V.Z., Hazelwood K.L., Roche P.M., Lukyanov S.,Zaraisky A.G., Davidson M.W., Chudakov D.M. (2009). Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem. J. 418 (3), 567–74.(IF 4.897) 

Shcherbo D., Merzlyak E.M., Chepurnykh T.V., Fradkov A.F., Ermakova G.V., Solovieva E.A., Lukyanov K.A., Bogdanova E.A., Zaraisky A.G., Lukyanov S.,Chudakov D.M. (2007). Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nat. Methods 4 (9), 741–6. (IF 23.565)

Merzlyak E.M., Goedhart J., Shcherbo D., Bulina M.E., Shcheglov A.S., Fradkov A.F., Gaintzeva A., Lukyanov K.A., Lukyanov S., Gadella T.W., Chudakov D.M. (2007). Bright monomeric red fluorescent protein with an extended fluorescence lifetime. Nat. Methods 4 (7), 555–7. (IF 23.565) 

Belousov V.V., Fradkov A.F., Lukyanov K.A., Staroverov D.B., Shakhbazov K.S., Terskikh A.V., Lukyanov S. (2006). Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat. Methods 3 (4), 281–6. (IF 23.565) 

Gurskaya N.G., Verkhusha V.V., Shcheglov A.S., Staroverov D.B., Chepurnykh T.V., Fradkov A.F., Lukyanov S., Lukyanov K.A. (2006). Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24 (4), 461–5. (IF 32.438)

Bulina M.E., Lukyanov K.A., Britanova O.V., Onichtchouk D., Lukyanov S.,Chudakov D.M. (2006). Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed. Nat.Protoc. 1 (2), 947–53. (IF 7.960) 

Bulina M.E., Chudakov D.M., Britanova O.V., Yanushevich Y.G., Staroverov D.B., Chepurnykh T.V., Merzlyak E.M., Shkrob M.A., Lukyanov S., Lukyanov K.A. (2006). A genetically encoded photosensitizer. Nat. Biotechnol. 24 (1), 95–9. (IF 32.438) 

Shkrob M.A., Yanushevich Y.G., Chudakov D.M., Gurskaya N.G., Labas Y.A., Poponov S.Y., Mudrik N.N., Lukyanov S., Lukyanov K.A. (2005). Far-red fluorescent proteins evolved from a blue chromoprotein from Actinia equina. Biochem. J. 392 (Pt 3), 649–54. (IF 4.654) 

Chudakov D.M., Lukyanov S., Lukyanov K.A. (2005). Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. Trends Biotechnol. 23 (12), 605–13. (IF 9.660) 

LukyanovK.A., ChudakovD.M., Lukyanov S.,VerkhushaV.V. (2005). Innovation: Photoactivatable fluorescent proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 885–91. (IF 37.162) 

Chudakov D.M., Verkhusha V.V., Staroverov D.B., Souslova E.A., Lukyanov S.,Lukyanov K.A. (2004). Photoswitchable cyan fluorescent protein for protein tracking. Nat. Biotechnol. 22 (11), 1435–9. (IF 32.438)

Chudakov D.M., Belousov V.V., Zaraisky A.G., Novoselov V.V., Staroverov D.B., Zorov D.B., Lukyanov S., Lukyanov K.A. (2003). Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nat. Biotechnol. 21 (2), 191–4. (IF 32.438)

Shagin D.A., Rebrikov D.V., Kozhemyako V.B., Altshuler I.M., Shcheglov A.S., Zhulidov P.A., Bogdanova E.A., Staroverov D.B., Rasskazov V.A., Lukyanov S. (2002). A novel method for SNP detection using a new duplex-specific nuclease from crab hepatopancreas. Genome Res. 12 (12), 1935–42. (IF 13.608)

Terskikh A., Fradkov A., Ermakova G., Zaraisky A., Tan P., Kajava A.V., Zhao X., Lukyanov S., Matz M., Kim S., Weissman I., Siebert P. (2000). "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science 290 (5496), 1585–8. (IF 31.027) 

Matz M.V., Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L., Lukyanov S.A. (1999). Fluorescent proteins from nonbioluminescentAnthozoa species. Nat. Biotechnol. 17 (10), 969–73. (IF 32.438) 

Akopyans N.S., Fradkov A.F., Diatchenko L.B., Siebert P.D., Lukyanov S.A., Sverdlov E.D., Berg D.E. PCR-based subtractive hybridization and differences in gene content among strains of Helicobacter pylori. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1998, V. 95, 13108-13113. (IF 9.737)

Diatchenko L, Lau YF, Campbell AP, Chenchik A, Moqadam F, Huang B, Lukyanov S, Lukyanov K, Gurskaya N, Sverdlov ED, Siebert PD. Suppression subtractive hybridization: a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1996, V. 93, 6025-6030. (IF 9.737)

Результаты исследований

1. Дальнекрасный флуоресцентный белок eqFP650 использован в исследовании механизмов опухолеобразования и метастазирования на мышиной модели рака молочной железы в сочетании с люминесцентным сигналом люциферазы Gaussia. Показано смешанное взаимоподдерживающее метастазирование для двух модельных типов опухолевых клеток, визуализируемых с использованием флуоресценции eqFP650 и люминесценции люциферазы или флуоресценции другого флуоресцентного белка. 

 01

Рис. (A) Флуоресцентная (белок eqFP650) и люминесцентная (светлячковая люцифераза) визуализация двух ко-пересаженных типов опухолевых клеток. (B) Ex vivo микроскопия лимфатического узла из мыши на панели A показывает ко-локализацию флуоресценции eqFP650 и GFP меченных клеток. (C) Флуоресцентная (белок eqFP650) и люминесцентная (комплементированная сплит-люцифераза Gaussia) визуализация опухолевых клеток. (D) Вырезанные первичные опухоли и метастазы из панели B: визуализированные сигналы флуоресценции eqFP650 и люминесценции комплементированной сплит-люциферазы Gaussia. Красные стрелки показывают метастазы в легких, в которых оба сигнала колокализованы. Зеленая стрелка показывает метастаз, характеризующийся только флуоресцентным сигналом eqFP650. 

Работа опубликована:

2. Выявлены структурные основы дальнекрасной флуоресценции белков eqFP650 и eqFP670.

Для понимания структурных основ сдвига спектров дальнекрасных флуоресцентных белков eqFP650 и eqFP670 была проведена работа по их кристаллизации и определения пространственной структуры. Данная работа была проведена в сотрудничестве с лабораториями В.З. Плетнева (ИБХ РАН) и Z. Dauter (USA). Было показано, что за батохромный сдвиг в этих белках ответственны две основные группы структурных изменений, по сравнению с другими флуоресцентными белками. Во-первых, наблюдается повышенная гидрофильность окружения ацилиминной группы красного хромофора за счет присутствия одной или трех молекул воды в eqFP650 и eqFP670, соответственно. Эти молекулы воды обеспечивают дополнительные водородные связи хромофора с белковым окружением, что приводит к сдвигу максимума эмиссии в красную область на приблизительно 15 нм. Во-вторых, в eqFP670 присутствуют остатки аспарагина в положениях 143 и 158 (вместо серина в этих положениях в eqFP650). Эти остатки аспарагина связаны водородными связями между собой и с хромофором, что приводит к дополнительному сдвигу эмиссии на 20 нм в eqFP670. Роль выявленных структурных изменений была подтверждена путем направленного мутегенеза.

Работа опубликована:

3. Разработан метод изучения взаимодействия опухоли и мезенхимных стволовых клеток с помощью флуоресцентного биоимиджинга.

Метод включает следующие основные стадии:

  • Выделение мезенхимных стволовых клеток из клеток стромы жировой ткани (СКЖТ) из кусочков жировой ткани человека.
  • Трансфекция СКЖТ геном красного флюоресцентного белка TurboFP635 методом лентивирусной трансфекции.
  • Введение меченых флюоресцентным белком СКЖТ мышам линии nude с привитыми опухолями Hela Kyoto.

Визуализация распределения СКЖТ в животных с применением флуоресцентного имиджинга на целых организмах, а также лазерной сканирующей конфокальной микроскопии выделенных тканей (с применением спектрального анализа).

СКЖТ, выделеные и охарактеризованые с помощью иммуноцитохимического анализа, имели фенотип мезенхимных стволовых клеток (экспрессировали CD105, CD49d, STRO-1) и дифференцировались в условиях in vitro в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлениях при культивировании в индукционных средах. Эффективность трансфекции СКЖТ геном красного флуоресцентного белка TurboFP635 составила 75%. Показано, что исследуемый тип стволовых клеток при системном введении способен мигрировать в селезенку, а при системном и местном введениях — в костный мозг, легкие и ткани опухоли реципиента. Таким образом, методы флюоресцентного биоимиджинга и лазерной сканирующей микроскопии могут быть использованы для изучения взаимодействия опухоли и мезенхиальных стволовых клеток. Они эффективно дополняют друг друга в получении общих знаний о распределении мигрирующих флюоресцентных клеток.

 

 02

Рис. Мониторинг миграции флюоресцентно-меченых СКЖТ методом флюоресцентного биоимиджинга у животных 2-й группы (ранняя стадия канцерогенеза, локальное введение СКЖТ). Квадратом указано место инъекции опухолевых клеток, пунктирной линией — место инъекции флюоресцентно-меченых СКЖТ, пунктирной стрелкой — флюоресценция места инъекции СКЖТ.

 

Работа опубликована:

 

 

Рис. Белок FusionRed в живых клетках. Изображения клеток, трансфецированных рекомбинантными генетическими конструкциями, кодирующими следующие слитные белки:

А. FusionRed-актин; В.FusionRed-Rab5a-7 (локализация в эндосомах); С. FusionRed-фибрилларин; D. FusionRed- ламин; E. FusionRed--тубулин; F. FusionRed-аннексин-A4; G. FusionRed-ER ( локализация в эндоплазматическом ретикулуме) H. FusionRed-кавеолин; I. FusionRed-c-Ha-Ras (мембранная локализация); J. FusionRed-эпитоп-RhoB-GTPазы (локализация в эндосомах); K. FusionRed-паксиллин-22; L. FusionRed- лизосомальный-мембранный-гликопротеин (мембранная локализация); M. FusionRed-lifeact (пептид, связывающий филаменты актина); N. FusionRed-PDHA1-10 (pyruvate dehydrogenase; митохондриальная локализация); O. FusionRed-кератин; P. FusionRed-миозин (легкая цепь); Q. FusionRed-c-src-N-7; R. FusionRed-PMP (сигнал пероксисомальной лакализации); S. FusionRed-EB3 (белок семейства RP/EB, ассоциированный с микротрубочками); T. FusionRed-Golgi (45 N-концевой аминокислотный остаток галактозилтрансферазы, локализация в комплексе Гольджи); U. FusionRed-кадгерин-10; V. FusionRed-виментин; W. FusionRed-зиксин; X. FusionRed- коннексин-43; Y. FusionRed--актинин.

Масштабная линейка, 10 мкм.

Работа опубликована:

5. Впервые получен флуоресцентный белок с хромофором на основе триптофана-66 в анионном состоянии.

Даже теоретическая возможность получения таких форм до настоящего времени не рассматривалась из-за исключительно высоких значений pKа индольной группы триптофана. Новый белок, названный WasCFP, обладает зеленой флуоресценцией с временем жизни флуоресцентного состояния более 5 нс, намного больше, чем у всех известных флуоресцентных белков (как правило, 2-3 нс, максимальное – 4 нс). Следовательно, WasCFP является удобной меткой для времяразрешенной микроскопии (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM), где этот белок предоставляет дополнительный «цвет» для многопараметрического биоимиджинга. Об анионном состоянии хромофора в новой спектральной форме свидетельствует рН-зависимое равновесие между формами с поглощением при 437 нм и при 494 нм, а также близкое поглощение белка mCerulean, денатурированного в сильной щелочи, где хромофор, очевидно, существует в виде аниона. Важно, что WasCFP показал принципиальную возможность существования флуоресцентных белков с анионным хромофором на основе триптофана, и, таким образом, открыл новое направление получения флуоресцентных белков с необычными и полезными свойствами.

 

Рис. Спектральные свойства WasCFP. (А) Спектры поглощения нового флуоресцентного белка WasCFP, показывающие рН-зависимое равновесие между нейтральным и анионным состояниями хромофора. (Б) Предлагаемая схема стабилизации анионного хромофора остатком лизина-61 и фото пробирок с WasCFP при рН 5 (слева) и рН 8 (справа).

Работа опубликована:

 

 

Рис. Светоиндуцируемая временная остановка делений клеток HeLa Kyoto с H2B–tKR. Представлены микрофотографии (наложение красной флуоресценции и проходящего света) одного и того же поля зрения через указанное время (в часах) после облучения зеленым светом. Видно, что нетрансфицированные клетки делятся нормально, в то время как клетки, экспрессирующие H2B–tKR, не подвергаются делению в течение первых 27 ч, после чего в них также начинаются митозы (показаны стрелками). Масштабная линейка 20 мкм.

Работа опубликована:

Поданы 3 заявки на изобретение.

Получен патент:

7. Проведено исследование фотодинамического действия белка KillerRed на опухоль HeLa (рак шейки матки человека) у иммунодефицитных мышей nude.

Протестировано 5 вариантов локализации белка в клетке. С помощью флуоресцентного имиджинга in vivo обнаружено, что облучение опухоли, экспрессирующей белок KillerRed, приводит к его выгоранию, сопровождающем фотодинамическую реакцию. Установлено, что лазерное воздействие на опухоли с белком с локализацией в хроматине клеток (H2B-tKR) приводит к наиболее выраженным патоморфологическим изменениям: нарушению целостности цитоплазматической и ядерной мембран, вакуолизации цитоплазмы, набуханию или сжатию клеток, отеку ядра, активации апоптоза. Таким образом, была впервые продемонстрирована принципиальная возможность фотоповреждения опухоли с помощью фототоксичного белка KillerRed.

 

Рис. Влияние фотодинамической терапии на опухоль с H2B-tKR на мышах. Вверху – обычное и флуоресцентное изображение мыши с опухолью (стрелка). Внизу – гистологический срез необлученной (слева) и облученной (справа) опухоли. Видны вызванные белком KillerRed патологические изменения клеток после воздействия светом

Подана заявка на патент.

Работа опубликована

8. Разработан метод анализа локализованной продукции пероксида водорода в живых системах.

Описание пространственно-временного распределения в клетке пероксида водорода на уровне отдельных компартментов и субкомпартментов чрезвычайно важно для понимания механизмов влияния этого важнейшего вторичного мессенджера на поведение клетки, его роли в регуляции сигнальных процессов и в патологиях. Для решения этой проблемы был разработан метод высокоспецифической и высокоселективной детекции пероксида водорода в различных внутриклеточных локализациях. Метод основан на использовании генетически кодируемого флуоресцентного сенсора HyPer, который направляется в определенный компартмент или субкомпартмент клетки путем слияния с известными белковыми сигналами внутриклеточной локализации или с целыми белками, характеризующимися искомой локализацией.

На основе биосенсора HyPer созданы локализованные флуоресцентные индикаторы PDGFR-HyPer, EGFR-HyPer и HyPer-TA для детекции Н2О2 в близком окружении рецепторов факторов роста PDGFR и EGFR, а также на цитоплазматической стороне мембраны эндоплазматического ретикулума. Показано, что полученные сенсоры правильно локализованы в клетках, HyPer в составе химерных белков сохраняет свойства биосенсора и реагирует на добавление экзогенного Н2О2.

С помощью полученных индикаторов впервые визуализирована локальная продукция и динамика Н2О2 в клетке в ответ на физиологическую активацию тирозинкиназных рецепторов ростовыми факторами. Установлено, что в клетках эпителиальной опухолевой линии HeLa-Kyoto продукция Н2О2 происходит на мембранах эндосом и эндоплазматического ретикулума. В фибробластах линии NIH-3T3 продукция Н2О2 локализована на плазматической мембране и мембране эндоплазматического ретикулума.

Таким образом, активация тирозинкиназных рецепторов, характерных для клеток разного происхождения, стимулирует различающиеся между собой паттерны генерации Н2О2. Впервые показано, что диффузия Н2О2 в цитоплазме эукариотических клеток ограничена 1-2 мкм, то есть мишенью Н2О2 являются только те белки, которые находятся в непосредственной близости от места его генерации.

 

Рис. Динамика изменения внутриклеточной концентрации Н2О2 в ответ на стимуляцию EGF. (A) Серия конфокальных изображений клеток линии HeLa-Kyoto, экспрессирующих pEGFR-HyPer. Клетки стимулированы EGF (50 нг/мл) в начальный момент серии (0 мин), соответствующие временные точки в минутах отмечены на каждом изображении. Верхний ряд серии изображений представляет внутриклеточное распределение отношения F500/F420. Нижний ряд серии изображений представляет внутриклеточное распределение флуоресцентного сигнала EGFR-HyPer (в канале с возбуждением флуоресценции при 488 нм). Границы и ядро одной из клеток обведены. Масштабная линейка: 15 мкм. (Б) Конфокальное рациометрическое изображение выделенной внутриклеточной области, содержащей интернализованный EGFR-HyPer. Интенсивность сигнала вдоль линий показана на графике (Г). Масштабная линейка: 5 мкм. (В) Графики, отражающие изменение концентрации H2O2 на ПМ (красный) и эндосомах (черный) клеток, изображенных на панели (А). (Г) Распределение отношения F500/F420 сигналов HyPer вдоль верхней (красный) и нижней (черный) линий, отмеченных на изображении (Б).

Работа опубликована:

9. Разработан метод одновременного мониторинга изменений концентраций клеточного пероксида водорода и фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфата с помощью одного сенсора.

Для расширения возможностей многопараметрического биоимиджинга создан генетически кодируемый флуоресцентный индикатор BtkPH-E41K-HyPer для одновременной детекции Н2О2 и активности фосфатидилинозитол-3’-киназы. Данный сенсор позволяет осуществлять мониторинг пероксида водорода по соотношению пиков возбуждения флуоресценции при 420 и 500 нм, а появление фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфата – по транслокации сенсора из цитоплазмы на мембрану. На клетках линии NIH-3T3 продемонстрирована возможность использования полученного индикатора в многопараметрическом исследовании внутриклеточных сигнальных процессов. С использованием BtkPH-E41K-HyPer впервые показана локальная активность фосфатидилинозитол-3’-киназы и продукция Н2О2 в области иммунологического синапса в CD4+ TH-лимфоцитах.

 
Рис. Мониторинг активности фосфатидилинозитол-3’-киназы и продукции Н2О2 в области иммунологического синапса в TH-лимфоцитах с помощью сенсора BtkPH-E41K-HyPer. Показаны микрофотографии TH-лимфоцита, формирующего контакт с шариком, покрытым ианти-CD3/CD28 антителами. Цыфры показывают время в минутах. Верхний ряд – изображения в проходящем свете. Два ряда ниже – флуоресцентные изображения при возбуждении при 420 или 505 нм. Нижний ряд – отношение сигналов флуоресценции (505/420), пропорциональное концентрации Н2О2. Шкала 10 мкм.

Работа опубликована:

1. Фототоксические эффекты связанного с лизосомой генетически кодируемого фотосенсибилизатора KillerRed

KillerRed является уникальным фототоксичным красным флуоресцентным белком, который может быть использован для индукции локального окислительного стресса при освещении зелено-оранжевым светом. В работе изучалась фототоксичность KillerRed, экспрессированного на мембране лизосом во фьюзе с Rab7 (гуанозинтрифосфатаза) со стороны цитоплазмы. Было обнаружено, что связанный с лизосомой KillerRed вызывает эффективную гибель клеток под действием света, как и при локализации в митохондриях и на плазматической мембране, о чем сообщалось ранее. Ингибиторный анализ показал, что лизосомальные катепсины играют важную роль в реализации фототоксичности KillerRed-Rab7. Мониторинг морфологии клеток, целостности мембраны и формы ядер позволил нам сделать вывод, что KillerRed-Rab7-опосредованная клеточная гибель происходит по пути некроза при высокой интенсивности света и по пути апоптоза при низкой интенсивности. Потенциально KillerRed-Rab7 может быть использован в качестве оптогенетического инструмента для запуска апоптоза или некроза в популяциях клеток-мишеней.

 
Рисунок. Фототоксичность KillerRed-Rab7 в клетках HeLa. Облучение зеленым светом индуцировало значительное снижение числа KillerRed-Rab7-содержащих клеток в смешанной популяции клеток HeLa, экспрессирующих TurboGFP или KillerRed-Rab7. Представлены изображения в зеленом и красном каналах и их наложение с изображением в проходящем свете для облученных (верхний ряд) и необлученных (нижний ряд) клеток. Бар 100 мкм.

Работа опубликована: Serebrovskaya, E.O., Ryumina, A.P., Boulina, M.E., Shirmanova, M.V., Zagaynova, E.V., Bogdanova, E.A., Lukyanov, S.A., Lukyanov, K.A. Phototoxic effects of lysosome-associated genetically encoded photosensitizer killer red (2014) Journal of Biomedical Optics  19  (7)  doi: 10.1117/1.JBO.19.7.071403 (Impact factor - 2.881) (full text)

2. По результатам исследований опубликовано и принято к печати 3 статьи и получен 1 международный патент:

  • Baranov M.S., Solntsev K.M., Baleeva N.S., Mishin A.S., Lukyanov S.A., Konstantin A. Lukyanov K.A., Yampolsky I.V. Red-Shifted fluorescent aminated derivatives of conformationally locked GFP chromophore. Chem. Eur. J. 2014, 20, 1 – 9.

  • Shirmanova MV, Gavrina AI, Aksenova NA, Glagolev NN, Solovieva AB, Shakhov BE, Zagaynova EV. Comparative Study of Tissue Distribution of Chlorin e6 Complexes with Amphiphilic Polymers in Mice with Cervical Carcinoma. J Anal Bioanal Tech. 2014. S1: 008.

  • Kleshnin M., Shirmanova M., Fiks I., Orlova A., Plekhanov V., Zagainova E., Lukyanov S., Turchin I. Trans-illumination fluorescence imaging of deepseated tumors in small animals. Photon Lasers Med 2014. In press.

  • Международный патент. Заявка № PCT/RU2012/000682. Авторы: Yampolsky I.V., Lukyanov K.A., Baranov M.S. Boron-containing 5-arylidene-3,5-dihydro-4h-imidazol-4-ones. Номер публикации: WO 2014031021 A1 от 27.02.2014.

2013 

1. Создан генетически кодируемый флуоресцентный индикатор для внутриклеточного обнаружения Н2О2 HyPer-3 с улучшенными характеристиками в отношении времени реакции и скорости.

HyPer-3 имеет расширенный динамический диапазон по сравнению с HyPer и значительно более быстрое окисление/восстановление по сравнению с HyPer-2. Получены in vivo изображения распределения H2O2 в тканях личинки полосатой данио. HyPer-3 был успешно применен для одноволновой флуоресцентной визуализации в режиме реального времени уровня H2O2 in vitro и in vivo.

 

Рис. График (слева вверху) демонстрирует время изменения соотношения индуцированного H2O2 в индивидуальных клетках, экспрессирующих HyPer-3 (черная линия) по сравнению с HyPer (синяя линия) и HyPer-2 (красная линия). Световые (справа вверху) и флуоресцентные (внизу) изображения β-актин:HyPer-3 трансгенных данио на 3,5 dpf этапе. Отметим, что высокий уровень флуоресценции в сердце связан с конструкцией HyPer-3, содержащей трансгенный маркер cmlc2:egf, который не способен флуоресцировать вне сердца (слева вверху, нижнее изображение). Внизу - изображения F500/F420 соотношения в эмбрионах данио после ранения, экспресирующих HyPer-3 (эмбрион слева) или HyPer (эмбрион справа). Цифры указывают время в минутах после ранения.
аа

Работа опубликована:

2. Изучены патоморфологические особенности действия белка KillerRed на опухоли животных при режимах лазерного воздействия, близких к используемым при фотодинамической терапии с химически синтезированными фотосенсибилизаторами.

Методами флюоресцентного имиджинга in vivo и ex vivo после лазерного облучения опухолей обнаружено выгорание белка KillerRed, что являлось критерием правильно подобранного режима воздействия и свидетельствовало о протекании фотодинамической реакции. В остром периоде после облучения в опухолях, экспрессирующих KillerRed, выявлены признаки деструкции ткани. Наряду с умеренными, обратимыми дистрофическими изменениями, такими как увеличение или уменьшение размеров клеток и вакуолизация цитоплазмы, в большинстве клеток обнаружены необратимые признаки повреждения — нарушение целостности клеточных и ядерных оболочек. Выполненное исследование впервые показывает принципиальную возможность фотоповреждения опухоли с помощью фототоксичного белка KillerRed при лазерном воздействии в режиме фотодинамической терапии.

 

Рис. Флюоресцентные изображения in vivo мыши nude с опухолями, экспрессирующими KillerRed-H2B: слева — до облучения; справа — сразу после облучения (593 нм, 150 мВт/см2, 20 мин). Облучению подвергалась опухоль слева. Средняя интенсивность флюоресценции опухоли до облучения составляла1·108 ед., после — 8·107 ед.
Рис. Результаты конфокальной флюоресцентной микроскопии опухолей ex vivo. Флюоресцентные изображения KillerRed-H2B-экспрессирующих опухолей: слева — контроль без облучения; справа — опухоль сразу после облучения (593 нм, 150 мВт/см2, 20 мин). Возбуждение на длине волны 543 нм, регистрация сигнала в диапазоне 597–661 нм. Размер изображений — 200х200 мкм
аа

Работа опубликована:

3. Определена кристаллическая структура желтого флюоресцентного белка phiYFPv (Phialidium) с разрешением 2.05 Å с целью улучшения свойств phiYFPv и его гомологичного мономерного биомаркера tagYFP.

Желтый флуоресцентный белок phiYFPv ( λmaxem ≈ 537 нм) с усовершенствованной укладкой был разработан на основе спектрально-идентичного «дикого типа» phiYFP, найденного в морской медузы Phialidium. Последний флуоресцентный белок является одним из двух известных природных белков, которые обладают спектром излучения в желто-оранжевом диапазоне (535-555 нм). Была определена кристаллическая структура phiYFPv с разрешением 2.05 Å. «Желтый» хромофор, формирующийся из последовательной триады Thr65-Tyr66-Gly67, принимает бициклическую структуру типичную для флуорофоров, излучающих в зеленой области спектра. Было показано, что идеальные антипараллельные π-укладки хромофора Tyr66 и проксимальные Tyr203, также как и Val205, на поверхности фенольного кольца хромофора являются главным образом ответственны за наблюдаемую желтую эмиссию phiYFPv при 537 нм. Cайт-направленный мутагенез на основе структуры использовался для идентификации ключевых функциональных остатков в окружающей среде хромофора. Полученные результаты были использованы для улучшения свойств phiYFPv и его гомологичного мономерного биомаркера tagYFP.

 

Рис. Трехмерное изображение границы раздела между A и B субъединицами в димерной структуре phiYFPv. Изображение получено с использованием SETOR.
аа

Работа опубликована:

4. Имиджинг микродоменов Н2О2 в рецепторах сигнальной тирозин киназы.

HyPer, рациомерический генетически кодируемый флуоресцентный сенсор, представляет собой перспективный инструмент для внутриклеточной регистрации перекиси водорода. При экспрессии в клетках in vitro, сенсор HyPer-cyto, диффузно распределенный в цитоплазме, регистрирует временные закономерности генерации H2O2. Однако быстрая диффузия сенсора в клетке приводит к усреднению сигнала от Н2О2 даже в тех случаях, когда Н2О2 продуцируется локально. В данной работе мы иммобилизовали сенсор в специфичных субклеточных компартментах, что позволило контролировать местное увеличение концентрации H2O2. В публикации представлен протокол рациометрического имиджинга и количественной оценки H2O2, продуцируемого клетками при физиологической стимуляции.

Рисунок. HyPer на поверхности мембраны эндоплазматического ретикулума со стороны цитоплазмы. (А) Схема конструкта Hyper-TA. (B) Широкопольные флуоресцентные изображения Hyper-TA-экспрессирующих клеток HeLa-Кyoto. Верхний ряд изображений показывает субклеточное распределение сенсора Hyper-TA. Нижний ряд изображений демонстрирует субклеточное распределение рациометрического сигнала. EGF (50 нг/мл) был добавлен между вторым и третьим кадрами. (С) Профиль изменения рациометрического сигнала HyРer вблизи цитоплазматической поверхности эндоплазматического ретикулума клеток, показанных на панели (B).

Работа опубликована:

5. Визуализация внутриклеточного перексида водорода с помощью генетически кодируемого флуоресцентного зонда HyPer

Флуоресцентный сенсор HyPer позволяет контролировать внутриклеточный уровень H2O2 с высокой степенью чувствительности и специфичности. В статье детальный протокол рациометрического имиджинга Н2О2, продуцируемого клетками при фагоцитозе, в том числе инструкции для проведения экспериментов  на различных коммерческих конфокальных системах, а именно Leica SP2, Leica SP5, и Carl Zeiss LSM, а также широкопольном микроскопе Leica 6000. Общие принципы получения рациметрических изображений могут быть использованы для визуализации продукции Н2О2 различными типами клеток при различных условиях.  

ris38

Рисунок. Продукция Н2О2 фагоцитирующими макрофагами, экспрессирующими HyРer. (А) Рациометрические конфокальные изображения клеток RAW 264.7 в указанные моменты времени (мин) после индукции фагоцитоза опсонизированных частиц зимозана. Бар 10 мкм. (В) Динамика продукции H2O2 отдельными фагоцитирующими клетками RAW 264.7. Черная и красная линии показывают продукцию H2O2 внутри верхней и нижней клетки на рисунке А. (С) Рациометрические конфокальные изображения клеток RAW 264.7,  демонстрирующие пики продукции H2O2 после каждого события фагоцитоза. Временные точки фагоцитоза отмечены звездочками. Бар 10 мкм. (D) Динамика продукции H2O2 в фагоцитирующих клетках RAW 264.7, показанных на панели С. Стрелки указывают на события фагоцитоза.

Работа опубликована:

6. Впервые изучена фототоксическая активность флавопротеина miniSOG в опухолевых клетках in vitro и in vivo.

Созданы клеточные линии HeLa Kyoto, стабильно экспрессирующие белок miniSOG в различных клеточных локализациях: плазматическая мембрана (miniSOG-mem), митохондрии (miniSOG-mito) и хроматин (H2B-miniSOG). Методами флуоресцентной микроскопии и флуоресцентного имиджинга in vivo оценена фототоксическая активность miniSOG в отношении опухолевых клеток, in vitro и на моделях животных соответственно. Облучение клеток синим светом in vitro индуцировало их гибель, однако данный эффект не был обнаружен в опухолях животных in vivo. Таким образом, показано, что флавопротеин miniSOG в условиях in vitro представляет собой эффективный генетически кодируемый фотосенсибилизатор для опухолевых клеток млекопитающих.

ris39

Рисунок. Флуоресцентная микроскопия клеток, экспрессирующих флавопротеин miniSOG. A - клетки HeLa Kyoto, стабильно экспрессирующие miniSOG, локализованный в плазматической мембране, митохондриях и в хроматине, соответственно. B - Time-lapse микроскопия немодифицированных клеток и клеток, экспрессирующих miniSOG-mito (наложение флуоресценции и проходящего света). Облучение клеток синим светом; числовым значениям соответствует время после облучения в минутах. Стрелками показаны гибнущие клетки.

Рисунок. In vivo флуоресцентный имиджинг опухолей у мышей линии nude на 19 день после инокуляции.  A, B – опухоли HeLa, экспрессирующие H2B-miniSOG; C, D – опухоли HeLa, экспрессирующие miniSOG-mito; E ,F – немодифицированные опухоли HeLa. Пунктиром показаны опухоли, облученные лазером (473 нм, 150 мВ/см2, 30 мин).  A, C, E – до облучения; B, D, F –после облучения

Работа опубликована:

7. Генетически кодируемый иммуннофотосенсибилизатор 4D5scFV-miniSOG - высоко селективный агент для прицельного фотоуничтожения опухолевых клеток in vitro.

Обнаружено, что рекомбинантный белок 4D5scFv-miniSOG оказывает весьма специфичный фотоиндуцированный цитотоксический эффект на HER2/neu-положительные клетки аденокарциномы молочной железы человека SK-BR-3 (IC50 = 160 нМ). 4D5scFv-miniSOG специфически связывается с HER2-позитивными клетками и интернализуется через рецептор-опосредованный эндоцитоз. Лечение раковых клеток аденокарциномы молочной железы одновременно иммунофотосенсибилизатором 4D5scFv-miniSOG и химиопрепаратом Taxol или белком JO-1 произвело выраженный аддитивный эффект.

ris41 

Рисунок. Локализация 4D5scFv-miniSOG в различных органеллах SK-BR-3 клетки. 4D5scFv-miniSOG и Lysotracker (А), 4D5scFv-miniSOG против Mitotracker (B). Зеленый цвет - 4D5scFv-miniSOG в клетках (I), красный цвет - органеллы, окрашенные специфичными красителями (II), наложение I и II флуоресцентных изображений (III). Диаграммы рассеяния частоты и интенсивности сигнала IV4D5scFv-miniSOG и органелло-специфичных красителей (iv). Диаграмма построена на основе измерения сигнала клетки, выделенной рамкой на рис. Biii.

Работа опубликована:

8. Разработана методика in vivo наблюдения первичного опухолевого узла и метастазов на основе оптимизированной люциферазы светляка luc2

Методами молекулярного клонирования получен лентивирусный вектор, несущий ген оптимизированной люциферазы светляка luc2. С помощью данной генетической конструкции создана линия опухолевых клеток Colo 26-luc2 (мышиная карцинома толстой кишки), стабильно экспрессирующя люциферазу luc2. Методами биолюминесцентного имиджинга in vitro и in vivo определена  чувствительность данной системы. Созданы модели первичного опухолевого узла и метастазов на основе Colo 26-luc2. Выполненная работа демонстрирует возможности биолюминесцентного имиджинга на основе оптимизированной люциферазы luc2 для прижизненной неинвазивной визуализации опухолевых процессов на уровне целого организма.

Рисунок. Биолюминесцентный имиджинг первичного опухолевого узла Colo 26-luc2. А – 4-й день после инокуляции, Б – 7-й день после инокуляции. D-люциферин, 150 мг/кг, внутрибрюшинно. Место формирования опухолевого узла показано стрелками

 

Рисунок. Биолюминесцентный имиджинг метастазов Colo 26-luc2 в легких на 9-й день после внутривенного введения опухолевых клеток. А – вентральная сторона животного, Б – вид сбоку. D-люциферин, 150 мг/кг, внутрибрюшинно.  

Работа опубликована:

9. KillerRed и miniSOG как генетически кодируемые фотосенсибилизаторы для фотодинамической терапии рака

Показан фототоксический эффект красного флуоресцентного белка KillerRed на экспериментальные опухоли HeLa у мышей. Лазерное воздействие на опухоли, экспрессирующие белок, вызвало значительные дистрофические клеточные изменения, такие как нарушение клеточных и ядерных мембран, отек ядра, вакуолизация цитоплазмы, и активация апоптоза. В опухолях, экспрессирующих фототоксичный флавопротеин miniSOG, патоморфологических изменений не наблюдалось. Дальнейшие эксперименты будут направлены на оптимизацию схемы фотодинамического лечения с белком KillerRed с целью ингибирования роста опухоли, а также на объяснение устойчивости опухолей HeLa к miniSOG-опосредованному фотоповреждению. Результаты представляют большой интерес для развития метода фотодинамической терапии рака.

ris44

Рисунок. Генетически кодируемый фотосенсибилизатор miniSOG-H2B в HeLa опухоли у иммунодефицитных мышей. а - фото, b - флуоресцентное изображение in vivo до лазерного облучения, с - после лазерного воздействия на длине волны 473 нм, 150 мВт/см2 в течение 30 мин. Облученная опухоль показана пунктиром. Возбуждение 465 нм, регистрация 520 нм.

Работа опубликована:

10. Исследование влияния цисплатина на уровень пероксида водорода и рН в клетках линии HeLa с использованием генетически кодируемых сенсоров

С помощью генетически кодируемого сенсора продемонстрировано отсутствие изменений уровня пероксида водорода и рН в клетках HeLa при воздействии цисплатина. В работе были использованы две клеточные линии карциномы шейки матки человека HeLa Kyoto, содержащие в цитоплазме генетически-кодируемый сенсор пероксида водорода HyPer-2C и сенсор pH HyPer-2C199S. Для оценки токсического действия цисплатина в отношении клеток HeLa использовали стандартный МТТ-тест. Изменения уровня рН и пероксида водорода (H2O2) определяли методом флуоресцентной микроскопии по изменению соотношения между интенсивностями флуоресценции при возбуждении сенсора на двух длинах волн: 500 нм и  420 нм (F500/F420). Во время эксперимента клетки содержали в микроинкубаторе при температуре 37.0ºС в безкарбонатной безсывороточной среде МЕМ. Раствор цисплатина в конечной концентрации, соответствующей IC50 по данным проведенного МТТ-теста, добавляли непосредственно в среду культивирования. В качестве контроля использовали среду МЕМ без добавления цисплатина. В результате проведённых исследований добавление цисплатина не вызывало изменений уровня пероксида водорода и рН в цитоплазме клеток линии HeLa Kyoto, экспрессирующих соответствующие сенсоры в течение всего времени наблюдения (20 минут) по сравнению с контролем.

 41  Рисунок. Уровень H2O2 в цитоплазме клеток линии HeLa-Kyoto-HyPer2 (а) и рН в цитоплазме клеток линии HeLa-Kyoto-HyPer2-С199S (б) после добавления цисплатина (IC50) и среды МЕМ без цисплатина. Стрелкой отмечено время добавления препарата.

Работа опубликована:

 

 

Back to top