МЕГАГРАНТЫ

Лаборатория биологии РНК и эпигенетики

О лаборатории

Наименование проекта
Молекулярные механизмы РНК-интеференции и защиты геномов у бактерий и эукариот.

№ договора:

14.W03.31.0007

Сайт лаборатории

Наименование организации
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук

Область научных исследований
Биология

Цель данного проекта изучение функций коротких некодирующих РНК у эу- и прокариот и разработка новых подходов к использованию РНК-интерференции в качестве инструмента редактирования геномов в фундаментальных и прикладных исследованиях, а также в терапевтических целях.

Ведущий учёный

aravinimage 

ФИО: Аравин Алексей Алексеевич

 

Дата рождения 02.11.1976

Гражданство
Россия

Ученые степень и звание
Профессор

Место работы
Калифорнийский технологический институт, США

Область научных интересов
Область научных интересов Биология РНК, регуляция экспрессии генов, эпигенетика, мобильные элементы

Достижения и награды
Профессор А.А. Аравин – один из ведущих ученых в области исследований биологии РНК и регуляции экспрессии генов. Ему принадлежит открытие нового класса некодирующих РНК, которое в свое время было отмечено как одно из важнейших открытий года журналом Science. Продолжение этих работ позволило понять функции некодирующих РНК в защите геномов от мобильных генетических элементов. Начиная с 2010 года, профессор А.А. Аравин возглавляет лабораторию в одном из ведущих мировых университетов – Калифорнийском технологическом институте. Проводимые им исследования по всем критериям находятся на самом высоком уровне, а их результаты опубликованы более чем в 60 высокоцитируемых статьях в лучших международных журналах. Работа А.А. Аравина получила финансовую поддержку основных научных фондов США. Профессор А.А. Аравин неоднократно выступал в качестве приглашенного лектора на крупнейших международных конференциях. Он награжден многими престижными наградами, включая высшую награду Национального института здоровья (NIH) для молодых исследователей, награду директора NIH в области инноваций и награду фонда Паккардов в области науки и технологий..


Y. Chen, E. Stuwe, Y. Luo, M. Ninova, A. Le Thomas, E. Rozhavskaya, S. Li, S. Vempati, J. Laver,
D. Patel, C. Smibert, H. Lipshitz, K. Fejes Tóth and A. Aravin (2016) Cutoff suppresses RNA
polymerase II termination to ensure expression of piRNA precursors. Molecular Cell. In press.
J. Hur, Y. Luo, S. Moon, M. Ninova, G. Marinov, Y. Chung and A. Aravin (2016) Splicingindependent
loading of TREX on nascent RNA is required for efficient expression of dual-strand
piRNA clusters in Drosophila. Genes & Development. 30(7):840-55
A. Webster, S. Li, J. Hur, M. Wachsmuth, J. Bois, E. Perkins, D. Patel and A. Aravin (2015) Aub
and Ago3 are recruited to nuage through two mechanisms to form a ping-pong complex assembled
by Krimper. Molecular Cell. 59(4):564-75. doi: 10.1016/j.molcel.2015.07.017
S. Manakov, D. Pezic, G. Marinov, W. Pastor, R. Sachidanandam and A. Aravin (2015) MIWI2 and
MILI have differential effects on piRNA biogenesis and DNA methylation. Cell Reports. 12(8):1234-
1243. doi: 10.1016/j.celrep.2015.07.036.
Cheloufi S, Elling U, Hopfgartner B, Jung YL, Murn J, Ninova M, Hubmann M, Badeaux AI, Euong
Ang C, Tenen D, Wesche DJ, Abazova N, Hogue M, Tasdemir N, Brumbaugh J, Rathert P, Jude J,
Ferrari F, Blanco A, Fellner M, Wenzel D, Zinner M, Vidal SE, Bell O, Stadtfeld M, Chang HY,
Almouzni G, Lowe SW, Rinn J, Wernig M, Aravin A, Shi Y, Park PJ, Penninger JM, Zuber J,
Hochedlinger K. (2015) The histone chaperone CAF-1 safeguards somatic cell identity. Nature.
528(7581):218-24. doi: 10.1038/nature15749
Marinov GK, Wang J, Handler D, Wold BJ, Weng Z, Hannon GJ, Aravin AA, Zamore PD,
Brennecke J, Fejes Tóth K. (2015) Pitfalls of mapping high-throughput sequencing data to
repetitive sequences: Piwi's genomic targets still not identified. Dev Cell. 32(6):765-71. doi:
10.1016/j.devcel.2015.01.013.
A. Le Thomas, G. Marinov and A. Aravin (2014). A Transgenerational Process Defines piRNA
Biogenesis in Drosophila virilis. Cell Reports. pii: S2211-1247(14)00676-7.
A. Le Thomas, E. Stuwe, S. Li, J. Du, G. Marinov, N. Rozhkov, YC. Chen, Y. Luo, R.
Sachidanandam, K. Fejes Tóth, D. Patel and A. Aravin (2014). Transgenerationally inherited
piRNAs trigger piRNA biogenesis by changing the chromatin of piRNA clusters and inducing
precursor processing. Genes & Development 28(15):1667-80.
D. Pezic, S. Manakov, R. Sachidanandam and A. Aravin (2014) piRNA pathway targets active
LINE1 elements to establish the repressive H3K9me3 mark in germ cells. Genes & Development.
28(13):1410-28. doi: 10.1101/gad.240895.114
Pastor WA, Stroud H, Nee K, Liu W, Pezic D, Manakov S, Lee SA, Moissiard G, Zamudio N,
Bourc'his D, Aravin AA, Clark AT, Jacobsen SE. (2014) MORC1 represses transposable elements
in the mouse male germline. Nat Commun. 5:5795.
Molaro A, Falciatori I, Hodges E, Aravin AA, Marran K, Rafii S, McCombie WR, Smith AD, Hannon
GJ. (2014) Two waves of de novo methylation during mouse germ cell development. Genes &
Development 28(14):1544-9.
I. Olovnikov, K. Chan, R. Sachidanandam, D. Newman, A. Aravin (2013) Bacterial Argonaute
samples the transcriptome to identify foreign DNA. Molecular Cell. 51(5):594-605.
A. Le Thomas, A. Rogers, A. Webster, G. Marinov, S. Liao, E. Perkins, J. Hur, A. Aravin, and K.
Fejes Tóth (2013) Piwi induces piRNA-guided transcriptional silencing and establishment of a
repressive chromatin state. Genes & Development 27 (4)
Muerdter F, Olovnikov I, Molaro A, Rozhkov NV, Czech B, Gordon A, Hannon GJ, Aravin AA.
(2012). Production of artificial piRNAs in flies and mice. RNA. 18(1):42-52



Результаты исследований

Основные публикации

Ryazansky S., Kulbachinskiy A., Aravin A.A. 2018. The Expanded Universe of Prokaryotic Argonaute Proteins. MBio 9(6). pii: e01935-18. doi: 10.1128/mBio.01935-18.
Lisitskaya L, Aravin AA, Kulbachinskiy A. 2018. DNA interference and beyond: structure and functions of prokaryotic Argonaute proteins. Nat Commun. 9(1): 5165. doi: 10.1038/s41467-018-07449-7.
Pupov D., Ignatov A., Agapov A., Kulbachinskiy A. 2019. Distinct effects of DNA lesions on RNA synthesis by Escherichia coli RNA polymerase. Biochem. Biophys. Res. Commun. In press.
Liu Y, Esyunina D, Olovnikov I, Teplova M, Kulbachinskiy A, Aravin AA, Patel DJ. 2018. Accommodation of Helical Imperfections in Rhodobacter sphaeroides Argonaute Ternary Complexes with Guide RNA and Target DNA. Cell Rep. 24: 453-462.
Олина А.В., Кульбачинский А.В., Аравин А.А., Есюнина Д.М. 2018. Белки-аргонавты и механизмы РНК-интерференции у эукариот и прокариот. Биохимия 83: 645-661.

Избранные публикации сотрудников ЛБРиЭ (2012-2017 гг., до создания ЛБРиЭ):

Miropolskaya N., Esyunina D., Kulbachinskiy A. 2017. Conserved functions of the trigger loop and Gre factors in RNA cleavage by bacterial RNA polymerases. J. Biol. Chem. 292: 6744-6752.
Petushkov I., Esyunina D., Kulbachinskiy A. 2017. s38-dependent promoter-proximal pausing by bacterial RNA polymerase. Nucleic Acids Res. 45: 3006-3016.
Ryazansky S, Radion E, Mironova A, Akulenko N, Abramov Y, Morgunova V, Kordyukova MY, Olovnikov I, Kalmykova A. 2017. Natural variation of piRNA expression affects immunity to transposable elements. PLoS Genet. 13: e1006731.
Y. Chen, E. Stuwe, Y. Luo, M. Ninova, A. Le Thomas, E. Rozhavskaya, S. Li, S. Vempati, J. Laver, D. Patel, C. Smibert, H. Lipshitz, K. Fejes Tóth and A. Aravin. 2016. Cutoff suppresses RNA polymerase II termination to ensure expression of piRNA precursors. Molecular Cell 63: 97-109.
J. Hur, Y. Luo, S. Moon, M. Ninova, G. Marinov, Y. Chung and A. Aravin. 2016. Splicing-independent loading of TREX on nascent RNA is required for efficient expression of dual-strand piRNA clusters in Drosophila. Genes & Development. 30: 840-855.
Esyunina D., Agapov A., Kulbachinskiy A. 2016. Regulation of transcriptional pausing through the secondary channel of RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113: 8699-8704.
Esyunina D., Turtola M., Pupov D., Bass I., Klimašauskas S., Belogurov G., Kulbachinskiy A. 2016. Lineage-specific variations in the trigger loop modulate RNA proofreading by bacterial RNA polymerases. Nucleic Acids Res. 44: 1298-1308.
Kuzmenko, A., Derbikova, K., Salvatori, R., Tankov, S., Atkinson, G. C., Tenson, T., Ott, M., Kamenski, P., and Hauryliuk, V. 2016. Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis. Scientific Reports 6: 18749.
Ryazansky SS, Kotov AA, Kibanov MV, Akulenko NV, Korbut AP, Lavrov SA, Gvozdev VA, Olenina LV. 2016. RNA helicase Spn-E is required to maintain Aub and AGO3 protein levels for piRNA silencing in the germline of Drosophila. Eur J Cell Biol. 95: 311-22.
A. Webster, S. Li, J. Hur, M. Wachsmuth, J. Bois, E. Perkins, D. Patel and A. Aravin. 2015. Aub and Ago3 are recruited to nuage through two mechanisms to form a ping-pong complex assembled by Krimper. Molecular Cell. 59: 564-575.
S. Manakov, D. Pezic, G. Marinov, W. Pastor, R. Sachidanandam and A. Aravin. 2015. MIWI2 and MILI have differential effects on piRNA biogenesis and DNA methylation. Cell Reports. 12: 1234-1243.
Esyunina D., Klimuk E., Severinov K., Kulbachinskiy A. 2015. Distinct pathways of RNA polymerase regulation by a phage-encoded factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112: 2017-2022.
Miropolskaya N., Esyunina D., Klimašauskas S., Nikiforov V., Artsimovitch I., Kulbachinskiy A. 2014. Interplay between the trigger loop and the F loop during RNA polymerase catalysis. Nucl. Acids Res. 42: 544-552.
Le Thomas A., Stuwe E., Li S., Du J., Marinov G., Rozhkov N., Chen YC, Luo Y., Sachidanandam R., Fejes Tóth K., Patel D., Aravin A. 2014. Transgenerationally inherited piRNAs trigger piRNA biogenesis by changing the chromatin of piRNA clusters and inducing precursor processing. Genes & Development 28:1667-1680.
Kuzmenko A, Atkinson GC, Levitskii S, Zenkin N, Tenson T, Hauryliuk V, Kamenski P. 2014. Mitochondrial translation initiation machinery: conservation and diversification. Biochimie 100: 132-140.
Miropolskaya N., Ignatov A., Bass I., Zhilina E., Pupov D., Kulbachinskiy A. 2012. Distinct functions of regions 1.1 and 1.2 of RNA polymerase s subunits from Escherichia coli and Thermus aquaticus in transcription initiation. J. Biol. Chem. 287: 23779-23789.



Основные задачи второго этапа работ по тематике мегагранта:

2.1 Исследование влияния мутаций в РНК-связывающих белках на транскрипцию предшественников piРНК; получение линий клеток млекопитающих с экспрессией аффинно-меченых РНК-связывающих белков для экспериментов по профилированию РНК-белковых взаимодействий.

2.2. Анализ нуклеиновых кислот, связанных с белками-Аргонавтами в клетках бактерий, их полногеномное картирование и изучение механизмов, обеспечивающих специфичность действия Аргонавтов; разработка системы для анализа влияния Аргонавтов на транскрипцию; анализ каталитической активности и специфичности сцепленных с Аргонавтами нуклеаз; подготовка экспериментов по анализу роли белков-Аргонавтов в защите клеток от мобильных генетических элементов.

2.3. Экспрессия бактериальных белков-Аргонавтов в клетках эукариот и анализ ассоциированных нуклеиновых кислот; разработка методов загрузки белков-Аргонавтов специфическими гидовыми молекулами нуклеиновых кислот, изучение их активности и взаимодействий с химерными гидовыми РНК in vitro.

По каждому из разделов проекта получены следующие основные научные результаты:

1) Обнаружен и исследован новый белок piРНК-пути у Drosophila, Su(var)2-10, который индуцирует внесение хроматиновой модификации H3K9me3 на кластеры piРНК, что необходимо для эффективной транскрипции предшественников piРНК.

2) Обнаружен и охарактеризован новый геномный локус, состоящий из повторов (Varel, vasa related repeats) и ответственный за продукцию piРНК в мужских герминальных клетках Drosophila. Показано, что данный локус способствует репродуктивной изоляции между D. melanogaster и близкородственными видами.

3) Для изучения взаимосвязи между структурой хроматина, РНК-связывающими белками и пост-транскрипционной судьбой РНК созданы новые клеточные линии, которые экспрессируют баркодированные трансгены, интегрированные в различные участки генома, и аффинно-меченые РНК-связывающие белки. Показано, что экспрессия баркодированных трансгенов зависит от места интеграции.

4) Проведен расширенный биоинформатический анализ бактериальных белков-Аргонавтов в геномных базах данных. Охарактеризованы основные семейства белков-Аргонавтов и их структурные особенности. Выявлена геномная ассоциация белков-Аргонавтов с нуклеазами различных семейств, хеликазами и ДНК-связывающими белками.

5) Проведен анализ библиотек коротких ДНК, ассоциированных с каталитически-активными белками-Аргонавтами в клетках бактерий. Показано, что основным местом продукции коротких ДНК является область терминации репликации в хромосоме, причем в их биогенезе может принимать участие комплекс RecBCD.

6) Проведен анализ библиотек коротких РНК, связанных с каталитически-неактивными Аргонавтами в клетках E. coli. Показано, что обогащение определенными гидовыми РНК в целом коррелирует с уровнем транскрипции соответствующих генов.

7) Исследован механизм расщепления ДНК-мишеней каталитически-активными белками-Аргонавтами. Установлено, что точность разрезания ДНК-мишени исследованными белками зависит от наличия фосфатной группы на 5’-конце гидовых молекул, при этом наличие мисматчей в гидовой ДНК, а также белок SSB способны стимулировать расщепление мишеней.

8) Разработаны методики экспрессии и очистки ассоциированных с белками-Аргонавтами нуклеаз, начато тестирование их каталитической активности.

9) Получен набор ДНК-матриц, содержащих в определенных позициях поврежденные нуклеотиды, с целью дальнейшего исследования влияния повреждений на процессинг ДНК-мишеней белками-Аргонавтами.

10) Разработаны методы исследования роли белков-Аргонавтов в защите бактериальных клеток от мобильных генетических элементов и бактериофагов.

11) Созданы системы для экспрессии бактериальных белков-Аргонавтов в клетках дрожжей и млекопитающих, проведена оптимизация кодонов, добавлены последовательности для направления белков в ядро, детекции их локализации и выделения. Отработаны методы трансфекции клеток человека данными конструкциями, осуществлена успешная экспрессия белков-Аргонавтов, проведен скрининг методов, позволяющих детектировать случаи геномного редактирования.

12) С целью разработки подходов к направленной загрузке специфических молекул гидовых РНК в белки-Аргонавты для экспериментов по геномному редактированию получены химерные варианты белков-Аргонавтов, содержащие в своем составе РНК-связывающие домены белков бактериофагов, которые могут специфически узнавать определенные мотивы РНК. Начат анализ их взаимодействий со специфическими гидовыми РНК, содержащими данные мотивы.



Основные задачи первого этапа работ по тематике мегагранта включали разработку методик профилирования РНК-белковых взаимодействий у дрозофилы, а также методов интеграции множественных баркодированных трансгенов в геном клеток человека; поиск новых генов бактериальных белков-Аргонавтов и ассоциированных с ними нуклеаз; клонирование генов перспективных белков-Аргонавтов, их экспрессию, очистку из клеток E. coli и анализ каталитических активностей; подготовку генетических конструкций для экспрессии белков-Аргонавтов в клетках эукариот. Эксперименты проведены с использованием модельных культур клеток дрозофилы, человека и бактерий, а также с использованием очищенных белков и нуклеиновых кислот in vitro. Получены следующие научные результаты.
1) Клонированы генетические конструкции и получены трансгенные линии дрозофилы с экспрессией белков процессинга пиРНК, содержащих аффинные метки. На примере белков hnRNP-семейства разработана методика профилирования РНК-связывающих белков в культуре клеток человека, которая позволяет детектировать преимущественное связывание определенных РНК-транскриптов с конкретными белками.
2) Освоены методики интеграции множественных баркодированных трансгенов в геном культивируемых клеток человека, позволяющие получить значительно число линий клеток с различным местом интеграции трансгена.
3) Проведен анализ геномных баз данных с целью поиска новых генов бактериальных Аргонавтов и ассоциированных с ними белков. Найдено более 800 новых генов, что в несколько раз превышает число ранее идентифицированных представителей этого семейства. Проведена детальная классификация белков-Аргонавтов и ассоциированных факторов.
4) Создана коллекция природных мезофильных культивируемых непатогенных бактерий, содержащих белки-Аргонавты различных классов. Проведено клонирование и химический синтез генов, кодирующих белки-Аргонавты и ассоциированные с ними нуклеазы. экспрессия новых белков-Аргонавтов в клетках E. coli и их очистка.
5) Изучена каталитическая активность и РНК/ДНК-специфичность выделенных белков-Аргонавтов in vitro. Показано, что несколько из них являются ДНК-зависимыми ДНК-нуклеазами и способны с высокой эффективностью осуществлять разрезание ДНК-мишеней.
6) Разработана уникальная система для анализа специфичности действия белков-Аргонавтов in vivo с использованием таргетных плазмид, в которых можно независимо регулировать уровень репликации, транскрипции и трансляции репортерных генов.
7) Подготовлены генетические конструкции для экспрессии каталитически активных и неактивных бактериальных белков-Аргонавтов в эукариотических клетках, которые будут использованы на следующих этапах работы для проведения экспериментов с культурами клеток человека.


 
В 2018 г. результаты работы лаборатории были представлены на следующих конференциях:
 
1. Конференция “Международный конгресс CRISPR-2018”, Новосибирск, Россия, 10-14 сентября 2018 г.
В конференции приняли участие Кульбачинский А.В. с устным докладом «Бактериальные белки-Аргонавты как потенциальный инструмент для редактирования геномов» и Кропочева Е.В. с постерным докладом «Исследование нуклеазной активности белка-Аргонавта из мезофильной бактерии Kurthia massiliensis»
 
2. Конференция “The 43rd FEBS congress”, Прага, Чехия, 7-12 июля 2018 г.
В конференции приняли участие Кропочева Е.В. с постерным докладом «Functional activities of DNA-guided and RNA-guided bacterial Argonaute proteins», Юдин Д.А. с постерным докладом «Catalytically active Argonaute proteins from mesophilic bacteria» и Лисицкая Л.А. с постерным докладом на тему «Interactions of a bacterial Argonaute protein with DNA targets in vitro»
 
3. Конференция “Microsymposium on Small RNAs”, Вена, Австрия, 18-20 июня 2018 г.
В конференции принял участие Котов А.А. с постерным докладом «Analysis of piRNAs from AT-chX loci in the testes of Drosophila melanogaster»
 
4. Конференция “Chromosome-2018”, Новосибирск, Россия, 20-24 августа 2018 г.
В конференции приняла участие Годнеева Б.К. с постерным докладом «The role of the SUMO ligase Su(var)2-10 in deposition of repressive chromatin marks and the piRNA pathway»
 
5. Конференция “The 11th International Conference on Ribosome Synthesis“, Орфорд, Канада, 1-5 августа 2018 г.
В конференции приняла участие Фефелова Е.А. с постерным докладом «Repression of ribosomal genes in Drosophila»
 
6. Конференция «Постгеном'2018», Казань, Россия, 29 октября – 2 ноября 2018 г.
В рамках данной конференции Кульбачинский А.В. представил приглашенный доклад на тему «В поисках геномных мишеней бактериальных белков-Аргонавтов»
 
7. Конференция «Regulatory and non-coding RNAs», Cold Spring Harbor Laboratory, Нью-Йорк, США, 15-19 мая 2018 г.
В конференции приняла участие Есюнина Д.М. с устным докладом «Prokaryotic Argonaute – how it finds a target and what happens after?»
 
8. Научная школа «XIX Зимняя молодежная школа ПИЯФ по биофизике и молекулярной биологии», Санкт-Петербург (пос. Рощино), Россия, 17-22 февраля 2018 г.
В конференции приняла участие Лисицкая Л.А. с устным докладом «Изучение взаимодействия белка-Аргонавта Rhodobacter sphaeroides с ДНК-мишенями»
 
В 2017 г. результаты работы лаборатории представлены на 2-х международных конференциях:
 
1) “13th International Conference on Drosophila Heterochromatin”, Кальяри, Италия, 4-10 июня 2017 г. – А.А. Аравин, приглашенный устный доклад.
https://hc2017.azuleon.org/programme.php
 
2) “Noncoding Genome”, Гейдельберг, 14-17 сентября 2017 г. – Д.М. Есюнина, устный доклад.
https://www.embo-embl-symposia.org/symposia/2017/EES17-07/programme/inde...
 
 

 

Back to top